南京大学黄小强/张艳课题组:烯烃还原酶与有机光催化剂协同催化实现烯烃的自由基氢叠氮化

DOI：10.1016/S1872-2067(26)65025-5

前言

近日，《催化学报》在线发表了南京大学黄小强与张艳教授团队在光酶催化领域的最新研究成果文章。该工作报道了一种烯烃还原酶（ERED）与有机光催化剂协同催化的新体系，在可见光照射下首次实现了烯烃的高对映选择性自由基氢叠氮化反应，为手性有机叠氮化合物的高效、可持续合成提供了全新策略。论文共同第一作者为：余进海、郝英迪，论文共同通讯作者为：黄小强、张艳、余进海。

背景介绍

光生物催化融合了酶催化的精准性与光化学的反应多样性，已成为拓展酶催化非天然转化的重要平台。近年来，烯烃还原酶（EREDs）与可见光催化的协同体系取得了长足进展，成功实现了多种净还原型及氧化还原中性反应，包括氢芳基化、氢内酯化、氢磺酰化和氢烷基化等反应。然而，实现氧化还原中性的碳–叠氮（C–N₃）键高对映选择性构建，仍是一个未解决的挑战。

叠氮基团（–N₃）是有机合成、药物化学和生物正交化学中的关键官能团，可参与点击化学、亲核取代、杂环合成等重要反应。在化学催化领域，烯烃的自由基氢叠氮化虽已有报道，但一直未能实现高对映选择性的合成，这源于叠氮自由基的高活性和瞬时性，使其立体化学控制极为困难。因此，发展生物催化策略以实现不对称自由基氢叠氮化，具有重要的科学意义和应用价值。

图1. 合成有机叠氮化合物的生物催化策略以及光生物催化烯烃自由基氢叠氮化反应的设计思路。

主要创新点

（1）首次实现了光生物催化的氧化还原中性、高对映选择性烯烃氢叠氮化反应，反应条件温和（室温、水相缓冲液、可见光照射），最高产率达99%，对映体比（e.r.）达>99.5:0.5。

（2）构建了烯烃还原酶（YersER）与有机光催化剂（曙红Y或荧光桃红B）的协同催化体系，突破了单一酶或单一光催化剂效率低下的瓶颈，并实现了0.1 mmol规模的制备级合成。

（3）通过紫外–可见吸收光谱、荧光淬灭实验、脱辅基酶对照实验、自由基捕获和氘代标记等系统的机理研究，阐明了“光激发→单电子氧化产生N₃•→自由基加成→酶控氢原子转移（HAT）→对映选择性产物生成”的协同催化机制，揭示了FMN辅因子在立体化学控制中的核心作用。。

主要研究结果

图2. 光生物催化氢叠氮化反应的酶库筛选和条件优化。

要点：

研究团队首先对一系列烯烃还原酶和有机/过渡金属光催化剂进行了系统筛选。来自Yersinia bercovieri的烯烃还原酶YersER与曙红Y（Eosin Y）的组合表现出最优的催化活性和对映选择性。在青色LED（500–510 nm）照射下，以5 mol%曙红Y、1.0 mol% YersER为催化剂，DMSO为共溶剂，在Tris缓冲液（pH 6.5）中室温反应12小时，模型产物（R）–2a的产率可达83%，对映体比（e.r.）达97:3。对照实验证实，酶、光催化剂和可见光三者缺一不可——无光照、无酶或以游离FMN替代酶时反应几乎无法进行；在空气氛围下产率和对映选择性均显著下降，进一步支持可见光驱动的自由基反应机理。将酶载量降低至0.2 mol%时，总转化数（TTN）可达190。

图3. 光生物催化氢叠氮化反应的底物范围及产物衍生化。

要点：

在底物拓展方面，该方法展现出优异的官能团兼容性。含有甲基、卤素、甲氧基、甲硫基、三氟甲基等取代基的芳基烯烃均可顺利反应，以最高99%的产率（HPLC测定）和最高>99.5:0.5 e.r.得到相应的手性叠氮产物。2–萘基、苯并噻吩基、苯并呋喃基和四氢萘基等稠环及杂环底物同样适用。值得注意的是，该策略可拓展至含有连续双手性中心的烯烃底物（2s, 2t），对映选择性最高达99.5:0.5 e.r.，非对映选择性达6.7:1 d.r.。此外，在0.1 mmol规模下可进行制备级合成，（R）–2a的分离产率达78%（96.5:3.5 e.r.），2f分离产率74%（92:8 e.r.）。产物中的叠氮基团可作为多功能合成手柄，通过铜催化叠氮–炔环加成（CuAAC）或叠氮还原反应，高效转化为手性三氮唑（3a: 78%产率, 95.5:4.5 e.r.; 3f: 76%产率, 91:9 e.r.）和手性伯胺（4a: 70%产率, 97.5:2.5 e.r.）等高价值含氮化合物。

催化机理阐释

图4. 催化机理研究实验。

为深入揭示反应机理，研究团队开展了系统的机理实验。紫外–可见吸收光谱显示，曙红Y使YersER的最大吸收峰从518 nm红移至533 nm，表明二者可能存在分子间相互作用；继续加入NaN₃后光谱进一步变化，暗示酶–曙红Y–NaN₃三元组分间的协同效应有利于叠氮自由基的生成。荧光淬灭实验表明，NaN₃可显著淬灭激发态YersER的荧光，却不影响游离曙红Y或荧光桃红B，说明SET过程发生在NaN₃与光激发酶复合物之间，而非与游离光催化剂——但单独激发态酶效率极低，酶结合的光催化剂对N₃•的高效生成不可或缺。脱辅基酶（apoenzyme）对照实验中，产物2a产率骤降至14%，重构全酶后活性完全恢复，证实酶结合的FMN辅因子是最终对映选择性HAT步骤的关键执行者。此外，TEMPO自由基捕获实验完全抑制产物并检测到苄基自由基加合物；氘代标记实验显示新建立体中心被91%氘标记，表明水参与了HAT过程。

图5. 提出的光生物催化氢叠氮化反应机理。

基于上述结果，作者提出了如下催化机理：可见光照射下，激发态酶–曙红Y复合物触发单电子氧化，将NaN₃氧化生成叠氮自由基（N₃•），同时黄素辅因子转变为半醌态（FMN_sq）；N₃•加成至烯烃碳碳双键，形成前手性苄基自由基中间体；最后，酶活性位点内的FMNsq介导立体选择性的氢原子转移（HAT），精准控制产物的绝对构型，生成对映体富集的（R）-构型有机叠氮产物，同时FMN再生回基态氧化态（FMN_ox），完成催化循环。

全文小结

1. 开发了一种由烯烃还原酶（YersER）与有机光催化剂（曙红Y/荧光桃红B）组成的新型协同光生物催化体系，首次实现了氧化还原中性、高对映选择性的烯烃自由基氢叠氮化反应，产率最高达99%，对映选择性最高>99.5:0.5 e.r.。

2. 该方法底物适用范围广，可兼容多种官能团取代的芳基烯烃、环状烯烃以及含连续双手性中心的底物，并可放大至0.1 mmol制备规模；产物叠氮基团可作为多功能合成手柄进一步转化为三氮唑、手性伯胺等高价值含氮化合物。

3. 系统的机理研究阐明了协同催化机制：光激发酶–光催化剂复合物负责N₃•的生成，而酶活性位点内FMN辅因子介导的立体选择性HAT是实现高对映选择性的核心，为利用天然酶骨架介导挑战性杂原子自由基反应提供了新范式。

作者介绍

余进海，南京大学特聘副研究员。主要研究方向为：光生物催化和生物正交领域，包括新型光酶催化体系以及生物正交反应的构建与开发。以第一作者（含共一第一）身份在Nat. Catal., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., Int. Ed., Chin. J. Catal., Chem Catal., Adv. Synth. Catal., Catal. Commun., Eur. J. Org. Chem.等国际一流期刊上发表论文9篇。

张艳，南京大学教授。主要研究方向为光化学生物学，具体包括：光诱导生物正交反应的开发；基于有机光反应构建用于解析活细胞等生物体系内复杂分子事件的“分子侦探”；以及基于光反应对生物体系进行时空分辨调控等。主持国家自然科学基金杰出青年基金项目、重点项目、面上项目及重大研究计划培育项目、科技部973课题等。2008年获霍英东教育基金，2009年入选教育部新世纪人才，2012年获江苏省杰出青年基金，2013年入选南京大学首批登峰B人才支持计划，2015年入选中组部“青年拔尖人才”，2025年当选中国化学会会士。以通讯作者身份在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Chem. Soc. Rev., Cell Chem. Biol., Chem. Commun.等等国际一流期刊上发表论文40余篇。近五年被正面他引1800余次。

课题组链接：https://hysz.nju.edu.cn/yanzhang/29020/list.htm

黄小强，南京大学教授。主要研究方向为：光酶催化、电酶催化及人工酶设计等领域。2020年获得教育部自然科学一等奖；2021年入选国家青年人才计划（海外）；2022年主持科技部重点研发计划青年科学家等项目，同年荣获全国黄大年式教师团队；2024年获达摩院青橙奖；2025年获科学探索奖、首届腾冲青年科学家奖和青年酶工程学家奖；2026年荣获陈嘉庚青年科学奖、中国化学会青年化学奖、江苏青年五四奖章等荣誉和奖励。以通讯作者身份在Nature, Nat. Catal., Nat. Synth., JACS, ACIE, Acc. Chem. Res等国际一流期刊上发表论文30余篇。