实验室张宇/马明/武昊安联合南京质检院梅秀明构建多重ROS协同抗菌的普鲁士蓝类似物人工酶

人工酶催化在生物治疗、污染物降解和抗菌等领域具有重要应用价值，其中类过氧化物酶（POD）模拟物通常通过活化H₂O₂产生·OH自由基来实现氧化反应。然而，天然血红素酶并不局限于自由基途径，而是可通过高价金属氧中间体实现更具选择性的氧化过程。相比传统过渡金属，镧系元素具有独特的4f电子构型、较大的离子半径和柔性的配位环境，为构建新型金属酶模拟物提供了更广阔的元素空间。针对镧系普鲁士蓝类似物（PBA）纳米酶催化机制尚不清晰的问题，作者构建了覆盖14种非放射性镧系元素的六氰铁酸盐框架库，系统揭示了镧系收缩对形貌、配位结构和H₂O₂活化路径的调控作用（图1），并筛选出CePBAs和TbPBAs分别作为自由基主导与结合氧主导通路的代表元素。

作者首先通过水/乙醇二元溶剂体系结合PVP辅助结晶，建立了一种温和的LnME合成策略。该方法不需要高温高压或复杂后处理，即可获得粒径约2 μm、组成均一的镧系PBA颗粒。随着镧系元素从La到Lu的离子半径逐渐减小，材料形貌呈现出清晰的半径依赖性演化：LaPBAs和CePBAs表现为规则六方双锥结构，Pr至Eu系列逐渐过渡，而Gd至Lu系列则形成夹角约60°的菱形片状结构。该结果说明，镧系收缩不仅是元素周期性质的体现，也可作为驱动PBA框架形貌和晶面暴露变化的内在结构因素（图2）。

进一步的结构表征显示，不同镧系节点会诱导PBA框架发生连续的配位与晶相变化。XPS结果表明，CePBAs和TbPBAs中分别存在明显的Ce⁴⁺/Ce³⁺和Tb⁴⁺/Tb³⁺组分，提示镧系节点与氰基配体之间存在显著电子转移；而Fe 2p信号在不同LnMEs中高度相似，说明低自旋FeC₆单元对整体催化活性的差异贡献较小。FT-IR与Raman光谱进一步发现，随镧系原子序数增加，C≡N伸缩振动峰系统性蓝移，反映出更小离子半径带来的局部电荷密度升高和C≡N键增强。

在类POD活性方面，所有LnMEs在酸性条件下均表现出一定H₂O₂活化能力，其中CePBAs在pH 3.6时比活最高，可达到5.8 U·mg⁻¹。DMPO电子顺磁共振结果显示，各类LnMEs均可产生DMPO-OH信号，且·OH浓度与类POD比活之间呈良好线性相关（R² = 0.917），表明自由基生成是类POD反应的重要来源。稳态动力学分析进一步显示，CePBAs具有更高的最大反应速率，其Vmax约为87 mM·min⁻¹。催化剂毒化实验表明，磷酸根对CePBAs活性的抑制明显强于SCN⁻，提示真正主导H₂O₂活化的是表面镧系节点而非低自旋FeC₆位点。值得注意的是，TbPBAs虽然·OH产率较低，却仍保持较高的TMB氧化能力，提示其反应中可能存在不同于自由基途径的结合氧中间体（图3）。

为验证非自由基通路，作者进一步考察了LnMEs的类卤过氧化物酶（HPO）活性。以celestine blue（CB）为探针时，TbPBAs表现出最强的Cl⁻氧化能力，并在pH 5.2附近达到最佳活性。PMSO氧化实验显示，PMSO₂生成比例与类HPO信号强度呈显著正相关，说明该过程依赖表面结合氧物种而非单纯·OH氧化。加入KCl后，EPR谱中出现DMPO-ClO加合物，进一步证明TbPBAs能够通过*O物种活化Cl⁻并生成含氯活性氧。PCA分析将·OH生成和PMSO₂转化分解为相反的主成分权重，从而在同一元素库中清晰划分出羟基自由基偏好型与*O偏好型通路：CePBAs位于·OH主导区，而TbPBAs、DyPBAs和ErPBAs更偏向结合氧主导区（图4）。理论计算和原位光谱进一步解释了Ce与Tb之间的机制分化。

在机制图谱指导下，作者构建了Ce/Tb双金属PBA体系，希望将Ce的自由基生成能力与Tb的结合氧活化能力整合到同一框架中。三种CeTbPBAs均成功合成，其中CeTb-1保持六方双锥形貌，并表现出与TbPBAs相当的类HPO活性和较高类POD活性。XRD结果显示CeTb-1在CePBA与TbPBA特征晶面之间出现过渡衍射峰，提示Ce/Tb共掺杂实现了晶格参数的连续调节；同时材料在水和酸性缓冲液中保持较稳定晶体结构，72 h内金属释放处于ppb水平，总浸出量低于0.26 wt%，说明其在抗菌相关条件下具有较好的短期稳定性。作者随后将CeTb-1用于生物膜抗菌验证。对于革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌，单独CeTb-1或H₂O₂几乎不产生明显杀菌作用，而CeTb-1 + H₂O₂组合可分别实现约3.66-log和2.77-log的细菌灭活，并显著清除两类细菌形成的生物膜。SEM结果显示，联合处理后细菌表面出现明显皱缩、孔洞和结构破坏。转录组结果进一步揭示，CeTb/H₂O₂相较H₂O₂单独处理诱导更强的氧化应激和代谢重编程，在E. coli中产生577个差异基因；抗氧化防御相关基因soxS、dps、ahpC、katE和trxC显著下调，而核糖体和硫代谢等通路发生广泛扰动。这说明双金属LnMEs通过协同产生·OH、HClO等多种ROS，同时破坏细菌氧化还原稳态与大分子完整性，最终导致生长抑制和死亡（图5）。