南京工业大学食品与轻工学院院长江凌教授在Cell子刊《Trends in Biotechnology》发表食品合成生物学领域的实验性研究论文

成果介绍

近日，南京工业大学食品与轻工学院联合南京师范大学食品与制药工程学院在Cell子刊《Trends in Biotechnology》发表题为“Carbon-efficient upcycling of agrifood waste into fatty acid ester by engineered Clostridium tyrobutyricum”的实验性研究论文。该研究通过迭代多模块合成生物学策略，对酪丁酸梭菌进行工程化改造，成功将稻草秸秆水解液和虾壳废弃物高效转化为食品香料丁酸丁酯，实现了农业食品废弃物到高价值食品风味物质的碳高效增值再造。南京工业大学博士研究生杨智晗为本文的第一作者，江凌教授和朱政明教授为共同通讯作者，研究工作还得到南京师范大学黄和院士的指导。该工作获得江苏省合成生物基础研究中心的项目支持

内容介绍

丁酸丁酯（Butyl Butyrate, BB）是一种短链脂肪酸酯（C8），因其独特的菠萝和香蕉香气而被批准作为食品调味剂，此外，其具有97.3的高辛烷值和优越的闪点特性，是极具潜力的航空生物燃料候选分子。然而，传统的工业丁酸丁酯生产依赖于石油衍生物通过费舍尔酯化反应合成，迫切需要开发更可持续的绿色生产方法。微生物发酵为可持续替代方案提供了可能，但培养基原料成本占微生物发酵总成本的30-70%，其中碳源和氮源贡献了原料成本的70-80%，严重制约了丁酸丁酯的工业化生产。此外，传统糖酵解途径中碳损失问题也限制了目标产物的最大理论产量。

针对上述挑战，本研究以工程改造生产丁酸和丁醇的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）为底盘细胞，首次建立了仅利用农业食品废弃物（稻草秸秆水解液和虾壳废弃物）的丁酸丁酯从头生物合成路线。研究者首先比较了不同来源的脂肪酶，发现来自丙酮丁醇梭菌的CALipA脂肪酶在37°C下展现出更高的催化活性，且选择性高达97.2%，被选为酯化反应的核心酶。随后，团队从酪丁酸梭菌基因组中筛选了84个内源启动子构建了启动子文库，通过精准调控前体丁酸和丁醇的供应，使BB产量提升至2.21 g/L。为解决产物毒性问题，研究创新性地设计了多酶共定位策略：利用膜结合位点将CALipA锚定在细胞内膜上促进产物外排，并进一步采用自组装肽系统将Cat1、AdhE2和CALipA三种酶共定位到同一功能复合体中，使最大生物量提高15.1%。为减少碳损失，团队引入了非氧化糖酵解（NOG）途径，并过表达去乙酰化酶Dac，使BB产量达到7.78 g/L。通过表达亚磷酸脱氢酶（PtxD）增强NADH再生，BB产量进一步提升至8.42 g/L。最终，研究团队开发了仅含有稻草秸秆水解液（碳源）和虾壳废弃物（氮源）的低成本培养基，在5 L生物反应器中采用两步催化策略（微生物发酵原位酯化结合固定化脂肪酶补充酯化），使丁酸丁酯产量达到31.16 g/L，选择性高达98.4%，生产率为0.325 g/L/h，较起始菌株提高了49.5倍。

本研究的核心亮点在于：1）首次实现了仅利用农业食品废弃物（稻草秸秆水解液和虾壳废弃物）作为唯二组分的丁酸丁酯从头生物合成；2）通过启动子工程、多酶共定位、NOG碳保存途径和辅因子工程等多模块迭代优化，构建了高效的细胞工厂，产量提升49.5倍；3）技术经济分析表明，废弃物来源培养基使原料成本降低53.6%；碳足迹评估显示，与传统糖发酵路线相比，净温室气体排放量减少63.4%。该研究展示了通过整合碳高效途径与低成本底物，可将农业食品废弃物转化为食品风味物质，为实现可持续循环生物经济和应对气候变化提供了可行的技术路径。

图1 丁酸丁酯生物合成途径的从头构建。

图2 基于启动子工程的丁酸丁酯合成前体供应的调控。

图3 膜锚定脂肪酶CALipA促进丁酸丁酯分泌。

图4 三酶空间共定位策略应用于丁酸丁酯的生物合成。

图5 引入非氧化糖酵解NOG途径强化碳保存及合成途径的乙酰化修饰调控。

图6 辅因子工程强化NADH供应。

图7 农业食品废弃物生产丁酸丁酯的5 L生物反应器发酵。