南京农业大学生科院蒋建东团队EST文章:基于多组学的Dehalogenimonas纯培养表征及对4-羟基-百菌清还原脱卤酶基因的解析

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4-羟基-百菌清厌氧脱氯菌群的富集

Figure 1. Characterization of the 4-OH-TPN-dechlorinating consortium.

本研究采用4-OH-TPN对脱氯菌群进行驯化富集。经过37天三个周期的培养，31.5 μmol的4-OH-TPN被逐步脱氯，生成4-OH-DPN（12.0 ± 0.4 μmol）、4-OH-MPN（13.0 ± 1.4 μmol）和4-OH-PN（1.3 ± 0.5 μmol），剩余底物仅1.3 ± 0.6 μmol（残留率4.0 ± 2.0%）。在此过程中，脱卤单胞菌的16S rRNA基因拷贝数从初始的4.9×10⁶ copies/mL显著增长至第21天的1.6×10⁸ copies/mL，并维持高丰度；其生长得率为7.3×10⁸ cells/(μmol Cl⁻)。菌群结构分析表明，富集后的脱氯菌群主要由脱卤菌（Dehalogenimonas）、产甲烷菌（Methanosarcina和Methanobacterium）以及发酵菌（Sedimentibacter、Sporomusa、Acetobacterium、 f_Anaerolineaceae、Proteiniphilum和Clostridium）组成，占整个菌群的95.1 ± 1.5%。脱氯过程伴随甲烷生成，累计产量达5.37 ± 1.37 mM。本研究最终获得了一个结构简单、脱氯功能稳定且以Dehalogenimonas为核心的功能菌群。

厌氧脱氯菌群中关键成员的功能角色解析

Figure 2. Gene expressions for the key metabolic pathways related to B₁₂ synthesis, CO metabolism and lactate metabolism at the transcriptional (A) and proteomic (B) levels.

本研究通过对第37天的4-OH-TPN脱氯菌群进行宏基因组测序与分箱，获得了34个中高质量的宏基因组组装基因组，覆盖了群落中所有丰度>1%的关键物种。结合宏转录组与蛋白质组数据，我们系统地解析了菌群在脱氯过程中的代谢互作。分析表明，Dehalogenimonas利用氢气和乙酸作为电子供体与碳源，二者均由发酵菌通过乳酸发酵提供。其中，Sporomusa sphaeroides bin.8编码并表达了完整的乳酸发酵产氢、产乙酸途径，是该功能的主要执行者。维生素B12是还原脱卤酶的必需辅因子。Dehalogenimonas自身无法合成B12，但包含钴胺素捕获合成基因且高表达。Sporomusa sphaeroides bin.8和产甲烷菌（Methanosarcina和Methanobacterium）则拥有完整的钴胺素从头合成途径，其相关基因在脱氯过程中活跃表达，表明它们可能为脱卤菌提供这一关键生长因子。此外，Dehalogenimonas的Wood-Ljungdahl途径不完整，可能导致代谢中间体一氧化碳（CO）积累，进而抑制其活性。菌群中多个成员（如Methanosarcina、Sedimentibacter、Sporomusa sphaeroides、Acetobacterium wieringae和Methanobacterium）编码的CO脱氢酶可能协助代谢CO，缓解潜在的抑制作用。综上，本研究发现Sporomusa sphaeroides bin.8作为一个核心互营伙伴，同时为Dehalogenimonas氢气/乙酸、合成维生素B12前体并可能协助代谢CO，扮演了多重关键支持角色。这一发现揭示了新的种间互作模式，为理解复杂菌群中脱卤功能菌的生存策略提供了重要依据。

4-羟基-百菌清脱氯菌株的分离

Figure 3. Isolation of the Dehalogenimonas sp. strain 4OHTPN1. 

基于宏基因组分析，发现该脱氯菌群中的脱卤单胞菌编码DcpA同源蛋白，且对1,2-DCA的脱氯速率（10.7 ± 0.6 μmol/天）显著高于对4-OH-TPN（1.3 ± 0.04 μmol/天），并能支持更高的细胞得率。因此，本研究选用1,2-DCA作为电子受体以促进Dehalogenimonas的分离。鉴于其基因组缺乏合成肽聚糖的能力，分离过程中使用氨苄青霉素和万古霉素抑制细胞壁合成。随着电子供体由乳酸改为氢气，并受高浓度1,2-DCA抑制，产甲烷菌与发酵菌逐渐消失，而Dehalogenimonas丰度持续上升。经多轮稀释培养后，其相对丰度达到99.9%（图3A,B），最终获得纯培养物，命名为菌株4OHTPN1。该菌株经PCR-RFLP及完整基因组测序证实为单一物种，细胞呈不规则球状，直径0.5-0.7 μm。它能够利用氢气或甲酸作为电子供体，乙酸作为碳源，并将三氯乙烯脱氯为顺/反-1,2-二氯乙烯，但未检测到其他测试氯化物的脱氯活性。全基因组中未发现已知三氯乙烯还原脱卤酶的同源基因，其对应的RdhA仍有待鉴定。

菌株4OHTPN1的完整基因组测序及泛基因组分析

Figure 4. Pangenome analysis of Dehalogenimonas sp. strain 4OHTPN1 with 11 Dehalogenimonas genomes available in GenBank database. 

Figure 5. Dynamic 4-OH-TPN and 1,2-DCA dechlorination by strain 4OHTPN1 under individual (A and C) and co-contaminants conditions (B).

本研究通过纯培养实验考察了菌株4OHTPN1对4-OH-TPN和1,2-DCA的脱氯能力与相关基因表达。结果显示，该菌株可独立降解两种污染物：4-OH-TPN脱氯速率约1.0 μmol/L/天，1,2-DCA则达8.6 μmol/天。当两者共存时，1,2-DCA能显著促进4-OH-TPN的脱氯速率（提升至2.9 μmol/L/天）及菌体生长，而4-OH-TPN对1,2-DCA脱氯无影响。利用多组学分析发现，不同的污染物特异性诱导了不同rdhA基因的高表达：在仅添加4-OH-TPN时，rdhA26（命名为htpnA）的转录与蛋白表达水平最高；而在仅添加1,2-DCA时，一个dcpA同源基因rdhA25表达最高。两者共存时，htpnA和rdhA25均为高表达基因。这一结果说明其脱氯活性由不同的特异性还原脱卤酶介导，而非双功能酶。蛋白质组数据进一步验证了HtpnA与RdhA25的高丰度存在。系统发育分析表明，HtpnA与已知的多氯联苯还原脱卤酶PcbA4一致性较高（65.3%），而RdhA25与DcpA高度同源（95.9%）。结合其在脱氯过程中的特异性高表达，强烈提示HtpnA负责催化4-OH-TPN的完全还原脱氯。菌株基因组中其他多个rdhA基因也有一定表达，可能参与脱氯途径的不同步骤，但其功能尚不明确。

环境意义

采用生物可利用性更高的替代电子受体分离有机卤呼吸细菌（OHRB），是攻克其生长缓慢、分离困难等瓶颈的有效策略。其核心原理在于，水溶性更高的有机卤化物通常能支持OHRB获得更快的生长速率，而OHRB基因组中多拷贝的rdhA基因为其利用多种有机卤化物提供了遗传可能。为避免在富集过程中目标脱卤功能丢失，结合qPCR技术同步监测功能菌及其特异性rdhA基因的动态已成为标准做法。该策略此前已成功应用于分离多种脱氯菌株。本研究继承并精准实践了这一策略：基于前期宏基因组分析发现的dcpA同源基因线索，我们创新性地使用1,2-DCA作为4-OH-TPN的替代电子受体进行分离，同时添加4-OH-TPN维持选择压力，并辅以活性监测与扩增子测序。这一综合方法成功筛选出高活性菌群，并最终分离得到纯菌株Dehalogenimonas sp. 4OHTPN1。比较基因组学证实，分离过程完整保留了其所有rdhA基因，未发生功能流失。这一成功案例表明，以同源功能基因为导向的“替代底物”策略，对于分离以水溶性低、降解缓慢的复杂污染物（如多溴联苯醚）为靶标的OHRB，具有普适性的方法学价值。从应用视角看，菌株4OHTPN1及其鉴定的关键基因htpnA具有明确的环境生物技术潜力。该菌株可直接作为针对4-OH-TPN污染场地生物强化的候选菌剂，而htpnA基因则可开发为监测原位脱氯进程的特异性分子标记。然而，单一菌株的应用常受限于其狭窄的底物谱、严苛的生存需求或有限的代谢能力。因此，构建功能互补、分工协作的合成微生物菌群，是提升生物修复系统效能与鲁棒性的前瞻性方向。早期的合成菌群构建多依赖于经验性共培养，例如依赖Sulfurospirillum multivorans为Dehalococcoides mccartyi提供氢气、乙酸和钴胺酰胺等必需因子以增强脱氯。当前，在系统微生物学方法的推动下，菌群设计正从经验试错转向理性工程。基因组尺度代谢模型与多组学整合分析等策略，为解析复杂互作、指导高效菌群的顶层设计提供了强大框架。本研究为这一理性设计范式提供了关键组件与模型模板。首先，分离获得的4OHTPN1菌株本身即可作为一个功能明确的模块，用于构建降解含氯芳烃的合成菌群。更重要的是，研究过程中揭示的该菌株与Sporomusa sphaeroides之间的互养关系—涉及氢气/乙酸的供给、维生素B₁₂的提供以及CO代谢的耦合—阐明了一个具体且可操作的微生物代谢模型。这一模型不仅指出了一个潜在的支持伙伴，更重要的是揭示了一套可被借鉴和移植的代谢支持逻辑。因此，本研究提供的菌株资源及其代谢互作知识，共同促进了面向卤代污染物修复的合成微生物群落的理性构建，同时也为在受控系统中揭示更复杂的未知微生物相互作用提供了一个绝佳的研究平台。

作者介绍

蒋建东 南京农业大学生命科学学院教授/博导、院长。国家“万人计划”科技创新领军人才，国家优秀青年科学基金获得者，教育部新世纪优秀人才，江苏省杰出青年基金获得者。主要研究领域为农业与环境微生物学。主持国家重点研发专项项目/课题、国家自然科学基金（中-以国际合作项目、中-欧国际合作课题）等项目，以（共同）通讯作者在Nature Food，Nature Communications，ISME J，Microbiome等SCI期刊上发表论文80余篇，获国家科技进步二等奖（第9完成人）、江苏省科学技术奖一等奖（第2、5完成人）等，一项成果入选2025中国农业科学十大进展。任中国微生物学会环境微生物学专业委员会副主任委员，中国土壤学会土壤生物与生物化学专业委员会副主任委员，江苏省高校生物学学科联盟副理事长，International Biodeterioration & Biodegradation杂志Associate Editor，Applied and Environmental Microbiology编委。