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PBJ | 南京农大叶永浩课题组靶向二羟酸脱水酶创制新型除草活性分子

2026-03-24 09:39:16

近日，南京农业大学叶永浩教授课题组联合中科院上海有机所/南京师范大学周佳海教授课题组，在Plant Biotechnology Journal期刊上在线发表了题为“De Novo Design and Synthesis of Novel Benzoxazinone Derivatives Targeting Dihydroxyacid Dehydratase”的研究论文。该研究基于新型除草剂作用靶标——二羟酸脱水酶（DHAD），发现苯并噁嗪酮分子骨架能够靶向DHAD，表现出广谱且高效的除草活性，同时对水稻和小麦具有较高的安全性，验证了DHAD作为新型除草剂靶标的可行性。此外，该类衍生物在植物与微生物间显示出良好的选择性，对哺乳动物细胞无显著抑制活性，安全性良好，为开发具有全新机制的绿色除草剂提供了重要的理论依据。

在作物生产中，杂草危害可造成超过30%的产量损失，严重威胁粮食安全生产。使用除草剂是目前防控杂草最主要的手段，然而，现有主流除草剂种类有限、作用靶标单一，不仅导致杂草抗药性日趋严重，也带来一系列环境安全问题。因此，针对新靶标研发新型除草剂，已成为保障农业可持续发展的迫切需求。支链氨基酸（BCAA）合成途径广泛存在于植物和微生物中，而在哺乳动物中缺失，这一物种间的差异，为开发高选择性除草剂提供了理想靶点。在该合成途径中，DHAD催化2,3-二羟基异戊酸和2,3-二羟基甲基戊酸分别转化为2-酮异戊酸和2-酮甲基戊酸，是BCAA生物合成过程中不可或缺的关键酶。因此，针对DHAD设计结构新颖、作用方式独特的小分子抑制剂，可为创制全新作用机制、低生态风险的的绿色除草剂提供新的策略。

1. 苯并噁嗪酮类衍生物的合理设计与结构优化

在DHAD催化活性腔中，底物通过与铁硫簇[2Fe–2S]和Mg2+的配位作用实现催化转化。对天然抑制剂aspterric acid（AA）与DHAD的共晶结构（PDB：9JPI）分析发现，AA能够同时与铁硫簇和Mg²⁺发生配位作用，从而有效竞争并阻断底物结合（图1a）。因此，在设计新型DHAD抑制剂时，引入可同时与这两个金属中心互作的基团是至关重要的策略。此外，AA的稠环片段与活性腔中的Tyr215和Phe181残基形成疏水相互作用，两者间的最短空间距离为8.49 Å（图1a）。这一结构特征表明，在抑制剂分子中引入尺寸匹配的芳香环结构，可有效增强与这两个芳香族残基间的π–π堆积或疏水作用，进而显著提升抑制剂与活性腔的结合稳定性和亲和力。

图 1 苯并噁嗪酮类衍生物的合理设计

苯并噁嗪酮（图1b）是一类天然含氮杂环化合物，因其在医药和农药领域展现出广泛的生物活性而备受关注。在除草剂研发中，已有部分苯并噁嗪酮衍生物（如丙炔氟草胺）作为原卟啉原氧化酶抑制剂，被用于防控多种杂草。基于此，本研究选择苯并噁嗪酮作为核心骨架，并引入酯基片段以增强其与金属离子的配位能力，设计并合成了一系列衍生物4aa–4bb。分子对接结果表明，抑制剂分子中的羰基氧原子能够同时与铁硫簇及Mg2+形成配位作用，同时苯并噁嗪酮环与邻近的氨基酸残基之间产生π–π相互作用（图1c）。

2. 苯并噁嗪酮类衍生物的除草活性和种属选择性

构效关系分析表明，在苯并噁嗪酮母核的N–H和C(sp³)–H位引入长烷基链或芳香基团并不能有效提升化合物的生物活性；相反，在其芳环上引入甲基或氢原子可显著增强除草活性。基于上述构效关系模型及结构相似性策略，我们设计并合成了目标化合物4bb。苗后温室除草活性试验表明，在150 g ai/ha剂量下，化合物4bb对阔叶杂草醴肠和反枝苋的抑制率超过75%，对多种禾本科杂草也表现出显著除草活性，尤其对狗尾草的防效接近阳性对照药剂。

进一步评估了高活性化合物4bb的作物安全性。在50 μg/mL和100 μg/mL浓度下，4bb未对小麦种子萌发造成显著影响，但幼苗生长速率（尤其是根系）较空白对照组有所减缓（图2a–2c）。在相同条件下，对照药剂五氟磺草胺（penoxsulam）对小麦芽长和根长的抑制作用更为显著。4bb对水稻幼苗生长的抑制程度也低于对照药剂penoxsulam（图2d–2f）。在200 μg/mL剂量下进行叶面喷雾处理，21天后观察发现，4bb处理组的水稻株高与空白对照组基本一致，仅鲜重略有下降，对水稻生长的抑制弱于penoxsulam处理组（图2g和2h）。相比之下，相同剂量下4bb对小麦植株的生长抑制作用相对更为明显（图2g和2i）。以上结果表明，4bb在低剂量下对小麦种子萌发副作用较小，且在苗后高剂量处理中对水稻表现出较高的安全性。

图2化合物4bb和五氟磺草胺（penoxsulam）对小麦或水稻的作物安全性

此外，在50 μg/mL浓度下，化合物4bb对多种细菌和真菌均无显著的抑制活性，表明该化合物在植物和微生物之间具备良好的选择性。为进一步考察该类化合物的生物安全性，我们采用CCK-8法检测了代表性化合物4ae、4ag、4bb对人源LO2、HaCaT及293T细胞系的毒性。结果表明，在100 μM浓度下，上述化合物均未显示显著细胞毒性，进一步证明了该类结构具有较高的安全性。

3. 苯并噁嗪酮类衍生物的作用机制

通过BCAA回补实验，证实了化合物4bb的除草活性与BCAA合成途径密切相关（图3a-3b）。经4bb喷雾处理拟南芥植株72小时后，DHAD基因表达显著上调，约为清水处理组的9倍（图3c）；而其上游的AHAS基因表达未见明显改变，KARI基因表达量则上调约4倍。通过分子对接比较4bb与AHAS、KARI及DHAD的结合稳定性，发现4bb与KARI结合较差，而与AHAS和DHAD的结合较为稳定（图3d）。采用微量热泳动（MST）技术分别测定4bb与两个靶标的亲和力，发现4bb与DHAD的Kd值为83.18 μM，强于其与AHAS的亲和力（Kd = 132.70 μM）（图3e–3f）。此外，DARTS实验结果显示，在纯酶体系中，随着4bb浓度增加，DHAD被蛋白酶Pronase E降解程度逐渐降低（图3g）；而在烟草叶片提取DHAD粗酶液中加入不同浓度4bb也能够增强DHAD蛋白的稳定性，进一步表明4bb能够与DHAD发生相互作用（图3h）。上述体内和体外实验共同表明，该类苯并噁嗪酮类衍生物主要通过作用于BCAA合成途径中的DHAD蛋白，从而发挥除草活性。