科研 |南京林业:单倍体银杏中黄酮代谢的转录组和蛋白质组相关性分析(国人佳作)
- 2026-04-20 02:10:28
科研 |南京林业:单倍体银杏中黄酮代谢的转录组和蛋白质组相关性分析(国人佳作)
导读
原名：Transcriptome and
proteome associated analysis of flavonoid metabolism in haploid Ginkgo
biloba 译名：单倍体银杏中黄酮代谢的转录组和蛋白质组相关性分析 期刊：International
Journal of Biological Macromolecules IF：8.025 发表时间：2022.10 通讯作者：郭起荣 通讯作者单位：南京林业大学 裸子植物自发产生单倍体是非常罕见的。自1922年在柑橘中发现天然单倍体以来，单倍体植物的研究逐渐显示出其魅力。单倍体材料表现出其他倍体无可比拟的优势，能够显著提高林木育种的育种速度。此外，与高倍体材料相比，单倍体可以显著降低破译高度杂合植物基因组的难度，并提高注释的准确性。因此，越来越多的研究者致力于寻找单倍体植物资源的开发。银杏是一种重要的经济树种，黄酮类化合物是其主要经济特性之一，在生物医学和美容保健方面应用广泛。研究表明，施肥、盐、温度、光照、复壮、种植密度、中波紫外线等多种因素可能影响银杏的总黄酮含量。除外部环境因子外，其他调控基因、转录因子（Transcription factors，TFs）和长链非编码RNAs在银杏黄酮类化合物的调控网络中也发挥着不同的作用。本研究首次应用转录组和蛋白质组分析单倍体和二倍体银杏之间的差异，并进一步探讨了倍体对银杏黄酮含量的影响以及转录和蛋白质水平的变化。该研究结果填补了银杏中不同倍体研究的空白，并开创了单倍体银杏研究。 1.单倍体银杏表现出较弱的生理特性 该研究中单倍体和二倍体银杏植物由马萨里克大学植物园友情提供，三个单倍体银杏品种分别命名为Clica、Rocky和Baldii；三个二倍体银杏品种分别命名为David、Tit和Maronia（图1A），它们均被嫁接在同一棵银杏树上，每个接穗长度相同，有两个芽，并于同年丰收季从移栽植物中收集成熟的银杏叶，保存至-80℃液氮速冻，便于提取RNA和蛋白质，每个样品重复3次。 采用高效液相色谱法测定了银杏中黄酮的含量，结果表明，单倍体的总黄酮含量明显低于二倍体（图1B），单倍体的总黄酮平均含量为1.06±0.07 mg•g−1，其中“Rocky”的总黄酮含量最低，为0.98 mg•g−1；而二倍体的总黄酮平均含量为1.06±0.12 mg•g−1，“Maronia”的总黄酮含量最高，为1.99 mg•g−1。单倍体银杏总黄酮中槲皮素的含量（37.33%）略低于二倍体（43.33%）。另外，采用YMJ-A叶面积测量仪测量成熟银杏的叶面积，发现成熟单倍体银杏的叶片总是比二倍体银杏的叶片小（图1A和1C），单倍体银杏叶片的平均叶面积为7.9±0.5 cm2，二倍体银杏叶片的平均叶面积为17.6±1.1 cm2。采用CIRAS-3仪测定银杏的光合速率，发现成熟单倍体银杏叶的净光合速率也始终低于二倍体（图1D）。 图1. 单倍体与二倍体银杏叶片的比较 （A）形态。（B）黄酮含量。（C）叶面积。（D）净光合速率。（误差棒= 1 cm，1× =单倍体，2× =二倍体） 2. 转录组学和蛋白质组学分析概述 为了更好地理解单倍体和二倍体银杏在转录调控和蛋白质表达上的差异，本文分别选取了单倍体中总黄酮含量最低的“Rocky”和二倍体中总黄酮含量最高的“Maronia”进行详细地转录组和蛋白质组分析。 RNA测序（RNA-Seq）生产了149.82 GB的有效序列（Q30>94%），平均样本量为24.97 Gb。总共获得了48671万个高质量的有效参数。在与最新的银杏参考基因组匹配后，从映射到参考基因组的有效参数中组装到29,036个基因。与二倍体银杏相比，单倍体银杏共检测到2452个DEGs基因，其中上调1149个，下调1303个。通过蛋白质组学分析，共鉴定出30,086个前体、68,151个已鉴定的光谱、27,250个独特肽段和6036个蛋白质。相比之下，在二倍体银杏中，上调蛋白397个，下调蛋白289个。 3. 差异富集分析 2485个DEGs基因共富集在35个生物过程（BP）、10个细胞组分（CC）和36个分子功能（MF）术语上。其中，富集度最高的BP类别有“解毒作用（GO：0098754）”、“细胞壁组织（GO：0071555）”和“外部封装结构组织（GO：0045229）”；MF中富集程度最高的三个子类别为“过氧化物酶活性（GO：0004601）”、“作用于过氧化氢受体的氧化还原酶活性（GO：0016684）”和“二磷酸腺苷结合（GO：0043531）”；CC项中富集程度最大的子类别是“细胞壁（GO：0005618）”、其次是“外部封装结构（GO：0030312）”和“外周细胞（GO：0071944）”（图2A）。同样地，对DEPs进行了GO功能富集分析，特别的是，富集在“核小体（GO：0000786）”和“DNA包装复合体（GO：0044815）”上的4个DEPs、富集在“FANCM-MHF复合体（GO：0071821）”上的13个DEPs以及富集在“DNA模板转录、启动（GO:0006352）”上的17个DEPs的表达均为下调（图2B）。 利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行转录组学分析结果显示，502个候选基因富集在107条生物信号通路上。最显著富集的通路是“单萜类生物合成（ko00902）”，有5个上调基因和3个下调基因；其次是“黄酮和黄酮醇生物合成（ko00944）”和“角质，木栓质和蜡质生物合成（ko00073）”（图2C）。与二倍体银杏植物相比，富集在97条KEGG通路上的686个DEPs在单倍体银杏中差异表达（P<0.05），差异最大的通路是“单萜类生物合成（ko00902）”，在单倍体中DEPs有3个上调，1个下调（图2D）。 图2.DEGs的富集分析 （A）DEGs的GO功能富集分析。（B）DEPs的GO功能富集分析。（C）DEGs的KEGG通路分类。（D）DEPs的KEGG通路分类。 采用PlantCyc数据库中可获取的银杏注释数据分析和预测银杏代谢途径，“生物合成”类别中富集了67%以上带注释的DEGs，其次是“前体代谢产物和能量的生成”和“降解、利用和同化”，依次富集了21.48%和11.01%。显著富集的前三个代谢途径分别是“光合光反应”（12.36%）、“光呼吸”（12.36%）和“脱落酸生物合成”（9.38%）。参与黄酮合成和积累的代谢途径主要有“黄酮醇生物合成”（3.63%）和“黄酮生物合成”（1.91%）（图3）。 图3. 植物循环数据库对DEGs的注释 4. TFs分析 通过对单倍体银杏转录组分析，共鉴定出1299个转录因子（Transcription factors，TFs），分布在54个TF家族中（图4A）。转录因子最多的家族是“ARR-B”（215，16.6%），其次是“AP2-EREBP”（191，14.7%）和“bHLH”（106，8.2%）。bHLH家族（碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，Basic helix-loop-helix）的转录因子被证实广泛参与调节银杏中黄酮合成，因此，本文进一步对单倍体银杏中bHLH家族的TFs进行了靶向基因分析（图4B），SPT（丝氨酸棕榈酰转移酶，Serine palmitoyl transferase）和MYC2（髓细胞组织增生蛋白2，Myelocytomatosis proteins 2）作为活性最强的转录因子，在单倍体银杏的黄酮调控中发挥着重要作用。通过GO富集分析，TFs主要富集在“核酸结合转录因子活性”和“转录因子活性，序列特异性DNA结合”两方面（图4C）。在KEGG通路富集分析中，TFs显著富集在“环境信息处理”（植物激素信号转导）和“生物体系统”（植物昼夜节律）上（图4D）。 图4. TFs分析 （A）TF家族分布统计分析。（B）bHLH家族TFs的靶向分析。（C）TFs的GO功能富集分析。（D）TFs的KEGG通路富集分析。 5. DEPs的亚细胞定位和蛋白质组与转录组的关联分析 亚细胞定位是决定蛋白质功能及其运作环境的最重要方面之一。本文利用WoLFPSort预测了单倍体和二倍体银杏中DEPs的亚细胞位置。根据预测结果，DEPs主要分布在叶绿体（249，36.3%）和细胞质（195, 28.4%,）中（图5A）。DEPs作为叶绿体具有活力，而叶绿体在高等植物中是光合作用的主要部位，这可能是导致单倍体银杏叶片比二倍体银杏叶片小的原因。 由于存在转录调节机制，转录组和蛋白质组数据的相关性较低。此时，九象限关联分析可以发挥关键作用，总共有189个mRNA和相应的蛋白表达水平相匹配（图5B）。另外，同时表达上调的116个基因和蛋白（象限3）以及同时表达下调的73个基因和蛋白（象限7）是值得关注的（图5C）。Pearson相关检验显示，蛋白组与转录组相关性有限，并且具有相同表达趋势的mRNAs与其对应的蛋白质之间的相关性也较低（图5D）。 图5. DEPs的亚细胞定位及mRNA与蛋白质表达之间的关系 （A）横坐标表示亚细胞定位，纵坐标表示蛋白质数量。（B）转录组、蛋白质组、DEGs和DEPs中量化基因的韦恩图。（C）mRNA和蛋白质关联的九象限图。每个点代表一个基因或蛋白质。（D）DEGs和DEPs之间的散点图和相关系数。 “角质，木栓质和蜡质生物合成”和“苯丙素类化合物生物合成”途径显著富集在第3象限，同时转录组和蛋白质组表达上调（图6A）。“内质网中的蛋白质修饰”和“玉米素生物合成”大幅富集在第7象限，同时转录组和蛋白质组表达下调（图6B）。然而，转录组和蛋白质组并未同时显著富集在同一GO术语和KEGG通路中（图6C, D）。 图6. 具有相同表达趋势的DEGs和DEPs的富集和相关性 （A）表达的DEGs和DEPs中同时上调的KEGG富集通路。（B）表达的DEGs和DEPs中同时下调的KEGG富集通路。（C）GO显著性分析图。（D）KEGG显著性分析图。每个点代表一个GO术语/通路。水平坐标表示在该术语或通路中富集的蛋白质组的-log10值（q-值），垂直坐标表示在该术语中富集的转录组的-log10值（q值）。黑色表示二项无统计学意义，红色表示仅有一项显著，绿色表示二项均显著。 6. 与黄酮生物合成相关的DEGs和DEPs分析 为了研究单倍体银杏中黄酮含量低于二倍体银杏黄酮含量的可能机制，本文进一步分析了两者在黄酮代谢途径上的差异。槲皮素是银杏黄酮中的主要苷元之一。调控槲皮素合成的FLS（黄酮醇合酶，Flavonol synthase）、DFR（二氢黄酮醇-4-还原酶，Dihydroflavanol 4-reductase）和CYP75A（细胞色素P75A，Cytochrome P75A）基因在单倍体银杏中表达显著低于二倍体（图7）。CYP75A的蛋白产物CYP75B1在单倍体银杏中也被下调。槲皮素生物合成途径的上游基因，如CHI3（查尔酮异构酶，Chalcone isomerase 3），在单倍体银杏中也被下调。但值得关注的是，ANR（花青素还原酶，Anthocyanidin reductase）和LAR（无色花色素还原酶，Leucoanthocyanidin reductase）基因在单倍体银杏中高度表达。 图7. DEGs和DEPs参与黄酮的生物合成。左边三个方格表示单倍体银杏，右边三个方格表示二倍体银杏。 “苯丙素生物合成”和“黄酮生物合成”中DEGs和DEPs表达相关性热图显示，4CLL9（4-香豆酸辅酶A连接酶样9，4-coumarate--CoA ligase-like 9），PAM（肽酰甘氨酸α酰胺化单加氧酶 Peptidylglycine alphaamidating
monooxygena），OTM1和FLSb的DEGs表达与下调的DFR，OTM1，PAL1和PER21b的DEPs表达存在较强的关联（图8）。然而，大量表达上调的DEGs和DEPs之间也存在显著的相关性，值得进一步探讨。 图8. DEGs和DEPs之间的相关性热图。垂直坐标为DEPs，水平坐标为DEGs。*: 0.01 < P < 0.05; **:
0.001 < P ≤ 0.01; ***: ≤0.001。 当个体基因表达变化很小时，经典的富集分析可能产生很少或无结果。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）可以有效弥补经典富集分析中对次要基因有用信息的缺失，并对功能单元的调控作用提供更全面的解释。单从单倍体银杏“黄酮生物合成”途径中DEGs的数量无法得出具体的结论，但从GSEA中可以看出，与黄酮生物合成相关的基因普遍下调（图9）。 图9. 黄酮生物合成途径DEGs的GSEA 7. 蛋白-蛋白互作网络分析 蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）的构建有助于揭示核心调控基因。苯丙素类化合物生物合成是黄酮生成的关键上游代谢过程。在这两种代谢途径中对DEGs和DEPs的联合分析更能够揭示导致单倍体银杏中黄酮含量减少的核心表达基因和蛋白质。从“黄酮生物合成”和“苯丙素生物合成”途径的377个背景基因中共筛选出58个DEGs，其中21个表达上调，37个表达下调。这些基因编码的蛋白质被分为三组，其中PAL、PAM、FLS和OTM1是第一组（图10）。PAL、PAM、FLS和OTM1可以被定义为单倍体银杏黄酮调控的中枢基因，它们与第二组DEGs之间具有十分密切的共表达关系。 图10. DEPs的蛋白-蛋白相互作用网络 8. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证 为了验证转录组数据的可靠性，本文随机选择了“黄酮代谢”和“苯丙氨酸生物合成”途径中的14个DEGs进行qRT-PCR（图11）。转录组结果与所选DEGs的实时荧光表达模式一致，表明转录组数据是可靠的。 图11. 实时荧光定量PCR中相对基因表达量 （A）基于FPKM水平的14个基因的表达模式。（B）实时荧光定量PCR检测相对表达量。柱状图中的竖线表示标准误差。 黄酮类化合物的含量是银杏的重要经济特性之一，但单倍体材料的价值并不在于黄酮类化合物的开发利用。通过对单倍体植物基因表达的研究，可以有效地识别其在高倍性材料中的基因排列错误。银杏单倍体的发现不仅对银杏，而且对其他裸子植物都具有重要意义。然而，自2016年发现天然自发单倍体银杏以来，目前并未出现同一基因型不同倍性的银杏材料。我们不能完全排除本研究中基因型对结果的影响。因此，将单倍体和二倍体银杏嫁接在同一基因型砧木上，尽可能减少不同基因型对结果的影响，并保证在相同的适宜环境中生长。 通过对同质园林常年试验的密切观察，发现单倍体银杏生长活力明显弱于同期二倍体银杏。本试验结果表明，单倍体银杏的叶面积、黄酮含量和净光合速率均小于二倍体银杏。与二倍体相比，单倍体叶片中黄酮组分的比例变化不大，但总量显著降低。不出所料，在单倍体银杏中几个已知的黄酮调控基因都有不同程度的下调。FLS、DFR、F3H（黄烷酮-3-羟化酶，Flavanone 3-hydroxylase）等基因的表达水平有不同程度的变化，从而导致不同实验条件下叶片中黄酮含量的变化。 转录组测序数据量显著增加，以最大限度地探索单倍体和二倍体银杏之间的差异，并与最新的参考基因组相比，显著提高了注释准确性。单倍体银杏中下调的DEGs数量并不是明显高于上调的DEGs数量。研究发现大量的DEGs富集在与植物生长代谢相关的通路上，不同倍性的亚美马褂木也是如此。然而，分析所有DEGs的表达趋势时，发现大多数DEGs在不同的代谢通路中都能显著富集，并且在GSEA中呈现出一种下调的表达趋势（图12）。只有“植物的MAPK信号通路”和“内质网中的蛋白质修饰”通路在上调的DEGs中高度富集。可以看出，与二倍体基因组相比，单倍体基因组的基因数有下降趋势。当叶子在八月成熟时，单倍体银杏的DEPs主要集中在叶绿体中，提示这些蛋白质可能导致单倍体银杏的光合作用较弱。转录组和蛋白质组的关联分析表明mRNA和蛋白质表达的同时下调主要与玉米素合成有关。作者进一步测定了实验材料中玉米素的含量，发现单倍体叶片中玉米素的含量确实低于二倍体。玉米素是一种存在于植物中的天然细胞分裂素，可以促进植物细胞分裂，防止叶绿素和蛋白质降解，减缓呼吸，维持细胞活力，延缓植物衰老。玉米素可能有助于单倍体和二倍体之间的不同特性。 通过转录组学和蛋白质组学相关分析表明，本研究银杏叶中mRNA与对应蛋白表达水平的相关性较低。mRNA的表达水平与其相应蛋白的相关性取决于许多调控因子和代谢过程。蛋白质相互作用可直接参与生物信号传递和基因表达调控。通过PPI分析，PAL、PAM、FLS和OTM1之间相互频繁的交互作用在单倍体银杏黄酮调控中起主要作用，这也是单倍体银杏功能基因组学的未来研究重点之一。 图12. GSEA分析结果中前15条通路 本研究继不同倍性材料发现后，首次结合转录组和蛋白质组分析了不同倍性银杏材料中黄酮含量的差异。单倍体银杏中黄酮含量较低可能是由于PAL、PAM、FLS和OMT1的表达下调所致。本研究进一步完善了银杏黄酮的调控网络，可以作为宝贵的单倍体银杏资源的基础。另外，为了使单倍体银杏材料更好地服务于银杏种质的革新，进一步分析单倍体银杏的网络调控机制，是下一步的研究方向之一。 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.10.125 
蛋白质组，专注蛋白质组学 《蛋白质组》是微科盟旗下专注于学术知识免费分享平台，内容主要包括分享蛋白组学最新文献，新闻，干货知识，视频课程和学术直播讲座。
点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路
生科云网址：https://www.bioincloud.tech/
编译：微科盟，编辑：微科盟Emma、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
银杏（Ginkgo biloba，一种模式裸子植物）是一种重要的经济树种，黄酮类化合物是其主要经济特性之一，因此，黄酮含量的高低决定了其经济地位的重要程度。研究表明，除外部环境因子外，其他调控基因、转录因子和长链非编码RNAs在银杏黄酮类化合物的调控网络中发挥着重要作用。不同数量的基因组复制可能会影响植物转录和代谢物的产生，已有研究表明同一物种的低倍体植物往往比高倍体植物表现出较弱的生理特征，这可能是由于植物基因转录和蛋白表达的不同所致，但其原因尚不清楚。在此，本研究测定了银杏三种单倍体和二倍体嫁接植株叶片中的黄酮含量，并首次结合转录组学和蛋白质组学分析了不同倍性银杏材料中黄酮含量差异及可能的调控机制。结果表明，单倍体银杏的叶面积、黄酮含量和净光合速率均小于二倍体银杏。单倍体的基因表达量也普遍低于二倍体，在2452个差异表达基因（DEGs）中，有1149个上调基因（46.8%）和1309个下调基因（53.2%）；在686个差异表达蛋白（DEPs），有289个蛋白表达上调（42.1%），397个蛋白表达下调（57.9%）。PAL，PAM，FLS，OMT1可能是银杏黄酮调控中的枢纽基因。综上，本研究证实了银杏单倍体具有较低的代谢趋势，并且指出了银杏单倍体中黄酮含量较低可能是由于相应调控基因表达量的减少和参与黄酮合成的基因下调所致。
亮点
（1）首次结合多组学分析单倍体银杏
（2）推测SPT和MYC2是广泛参与调控单倍体银杏黄酮的转录因子。
（3）PAL、PAM、FLS和OTM1最有可能是银杏黄酮调控中的枢纽基因。
论文ID
实验设计
实验结果
讨论
结论
----------微科盟更多推荐----------
科研 |四川农科院&川大：对黄色金针菇的多组学联合分析揭示了采后氧化损伤响应机制（国人佳作）
科研 |中国林科院&山东农大：木质素生物合成对镉耐受性的分子机制研究：馒头柳的形态、转录组和蛋白质组分析（国人佳作）
获取此文献原文PDF、申请加入学术群，联系您所添加的任一微科盟组学老师即可，如未添加过微科盟组学老师，请联系组学老师30，无需重复添加。
请关注下方公众号
了解更多蛋白质组知识
蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。
也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。
本文来自网友投稿或网络内容，如有侵犯您的权益请联系我们删除，联系邮箱：wyl860211@qq.com 。
