南京中医药大学丨黄腐酚联合丁酸梭菌靶向赖氨酸乙酰化抑制艰难梭菌:蛋白质组学解析抗菌新机制

研究设计

首先构建 DSS 诱导的 Caco-2 肠上皮细胞炎症模型，评估黄腐酚对结肠炎叠加艰难梭菌感染的保护作用及对炎症通路的调控；再通过体外实验检测黄腐酚和丁酸梭菌上清对艰难梭菌定植、生长、产毒的影响；随后利用蛋白质组学和 TMT 标记的赖氨酸乙酰化修饰组学技术，分析二者对艰难梭菌蛋白质组和乙酰化修饰谱的改变，结合生物信息学筛选核心调控通路和靶点；最后聚焦糖酵解关键酶 FBA，通过质粒构建、蛋白纯化、定点突变和酶活实验，验证其乙酰化位点（K280）的功能，阐明二者抗艰难梭菌的共同分子机制。

研究结果

黄腐酚可显著缓解艰难梭菌对 DSS 诱导的 Caco-2 细胞的损伤，提高细胞活力并抑制 NF-κB 等炎症通路激活；体外实验中黄腐酚和丁酸梭菌上清均能减少艰难梭菌的肠道定植、抑制其生长并下调毒素基因 tcdA、tcdB、tcdR 的表达；蛋白质组学显示二者均显著重塑艰难梭菌蛋白质组，黄腐酚主要影响氨基酸合成、碳代谢等通路，丁酸梭菌上清则靶向核糖体生物发生和同源重组通路；乙酰化修饰组学发现二者均广泛调控艰难梭菌赖氨酸乙酰化水平，且共同靶向糖酵解通路，鉴定出 FBA 的 K280 为关键乙酰化位点，该位点的定点突变会显著降低 FBA 的催化活性；二者通过相反方式调控糖酵解酶丰度，但均通过乙酰化干扰糖酵解代谢，最终降低艰难梭菌毒力。

Fig1：验证艰难梭菌会加重 DSS 诱导的 Caco-2 细胞损伤，而黄腐酚可改善该损伤、抑制炎症通路激活；通过蛋白质组学证实 DSS 和艰难梭菌会显著改变 Caco-2 细胞蛋白质组，黄腐酚可逆转艰难梭菌引发的宿主蛋白表达异常，揭示其对宿主肠上皮的保护机制。

Fig2：证实黄腐酚能抑制艰难梭菌对 Caco-2 细胞的定植、增殖及毒素基因表达；蛋白质组学发现黄腐酚重塑艰难梭菌蛋白质组，影响碳代谢、氨基酸合成等通路，下调鞭毛组装相关蛋白，从蛋白质水平阐释黄腐酚对艰难梭菌毒力的抑制机制。

Fig3：证明丁酸梭菌上清与黄腐酚具有相似的抗艰难梭菌效果，可抑制其定植、生长和产毒；蛋白质组学显示其主要下调艰难梭菌核糖体相关蛋白、上调同源重组修复蛋白，且与黄腐酚共同调控鞭毛组装通路，提示二者存在共同的抗菌靶点。

Fig4：通过乙酰化修饰组学解析黄腐酚对艰难梭菌赖氨酸乙酰化的调控特征，发现其广泛改变乙酰化位点，且乙酰化修饰主要富集于碳代谢、糖酵解等通路；证实黄腐酚可使糖酵解酶发生高乙酰化，揭示其通过乙酰化调控糖酵解的分子特征。

Fig5：解析丁酸梭菌上清对艰难梭菌乙酰化修饰谱的影响，发现其主要调控核糖体蛋白的乙酰化，且显著下调糖酵解相关酶的丰度和乙酰化水平；进一步证实丁酸梭菌上清通过乙酰化靶向艰难梭菌糖酵解和核糖体合成通路。

Fig6：筛选出黄腐酚和丁酸梭菌上清共同调控的糖酵解通路乙酰化蛋白，鉴定出 FBA 的 K280 为关键保守乙酰化位点；通过定点突变和酶活实验，证实 FBA K280 乙酰化对其催化活性至关重要，为二者抗艰难梭菌的核心靶点。