南京大学谢然《JACS》:一种用于时空可控、蛋白质选择性及体内聚糖编辑的光激活糖酶平台

本文开发的GLOBE（Glycoenzyme Light-mediated Optical control for Biosurface Editing）平台，通过在糖酶活性中心或附近位点特异性引入光笼非天然氨基酸（如邻硝基苄基酪氨酸ONBY），实现了糖酶活性的光控激活，从而能在时空分辨率下对细胞表面聚糖进行精准编辑。该平台具有时空精准性，可通过365 nm紫外光或上转换纳米颗粒（UCNPs）介导的980 nm近红外光激活，实现微米级空间分辨率和分钟级时间分辨率的聚糖编辑；同时具备蛋白质选择性，结合MUC1靶向适配体能够实现特定蛋白质（如MUC1）表面聚糖的选择性氧化，有效避免脱靶反应。此外，该平台还支持多酶级联与体内应用，不仅可扩展至唾液酸酶等多种糖酶，构建正交光响应级联反应（如唾液酸去除后增强半乳糖氧化），还能通过UCNPs克服紫外光组织穿透限制，成功在小鼠肿瘤模型中实现体内聚糖编辑。

图2. 光笼化GAO的构建与验证。(A) GAO的活性位点（PDB: 1GOG）。(B) 西部印迹（抗His）分析显示选定GAO近端突变体在大肠杆菌中表达情况，实验组添加或不添加 ONBY 。凝胶电泳以野生型GAO作为参照。(C) 纯化GAO-Y405ONBY（GAOM）的LC−MS分析。预期值：69743 Da，实测值：69740 Da（GAOM ，-M）。(D) 不同光照条件下GAO与 GAOM 的Amplex Red检测27。误差线代表三次重复实验的标准偏差。(E) GAOM 处理的A549细胞共聚焦荧光显微镜图像。细胞经0.02 mg/mL灭活 GAOM 处理，照射不同时间（0−5分钟），继续孵育20分钟，随后进行 FTZ 染色。比例尺：25 μm 。(F) 不同照射时间（1−5分钟）后 GAOM 的LC−MS分析。(G) 一步法标记 GAOM 处理的A549细胞共聚焦荧光显微镜图像。细胞经0.02 mg/mL灭活 GAOM 处理，照射不同时间（0−5分钟），继续孵育20分钟，随后进行肼-AF488染色。比例尺：25 μm 。(H) GAOM 及其活性位点的代表性分子动力学结构。Cu2+离子以紫色球体表示，关键残基以棍状图示，与 β -D-半乳糖的氢键用金色虚线标出。关键相互作用的平均距离已标注，具体数值见图S18。

经RgGH33-Y436ONBY（RgGH33M）处理的MCF-7细胞共聚焦荧光显微镜图像。细胞用0.1 mg/mL RgGH33M处理，冰上照射5分钟（有或无UV照射），继续孵育20分钟，随后进行PNA- FITC 染色。比例尺：25 μm 。(B)MCF-7细胞聚糖编辑的流式细胞术分析。误差线代表三次生物学重复实验的标准偏差。采用双尾t检验进行统计分析。***P < 0.001。****P < 0.0001。(C)图3B流式细胞术分析的代表性直方图。a-f组别标注与图3B实验条件一致。

图4. 使用 GAOM -apt验证MUC1选择性聚糖修饰。(A) GAOM -apt制备示意图。(B) GAOM -Tz/Apt-TCO偶联反应的SDS-PAGE分析。将 GAOM -Tz与Apt-TCO混合并孵育不同时间及摩尔比，随后选取混合比为1:5（GAOM -Tz与Apt-TCO）的样品。(C) 不同光照条件下GAO、 GAOM -G与 GAOM -apt的Amplex Red检测结果。误差线表示三次重复实验的标准偏差。(D) GAOM -apt处理的共培养MCF-7与HepG2细胞共聚焦荧光显微镜图像。高MUC1表达的MCF-7细胞（DiD染色，红色信号）与细胞表面靶向MUC1标记（绿色信号）相关联。细胞核通过Hoechst 33342染色（蓝色信号）显示。比例尺：10 μm 。

图5. (A) 光触发单细胞时空聚糖编辑示意图。(B) 共聚焦荧光显微镜图像显示选定区域A549细胞的标记情况。细胞经 GAOM 孵育后，按实验流程对目标区域(ROI)内的细胞进行照射。孵育10分钟后，用肼基-AF488与细胞反应，并通过Dragonfly显微镜(LeicaDMI8)观察。使用Fusion软件(Oxford Instruments)以0.25 μm 轴向步长采集Z轴堆栈图像，采集范围为焦平面±25 μm 的对称区域，总成像深度达50 μm 。图中插图显示对应的二维共聚焦图像。(C) 选定单细胞按图5B处理流程，用肼基-AF594反应后，以鬼笔环肽-YF488进行染色。(D) 图5C的三维共聚焦成像。细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色信号）。图像通过Imaris 10.2.0软件分析。(E) GAOM 介导的光触发细胞间耦合示意图。(F) 共聚焦荧光显微镜图像显示Jurkat细胞与MCF-7细胞间的光依赖性耦合。Jurkat细胞预先用Cell Trace CFSE（C34554）染色，随后通过两步偶联程序进行肼修饰。MCF-7细胞预先用Cell Tracker Deep Red（C34565）染色。肼修饰或未修饰的Jurkat细胞重悬后加入MCF-7细胞，随后在光照或黑暗条件下与 GAOM 共孵育。共孵育后，通过共聚焦激光扫描显微镜（Leica SP8）观察细胞间相互作用。比例尺：5 μm 。(G) 光触发T细胞-4T1细胞耦合增强细胞毒性和细胞因子分泌的示意图。(H) 和 (I) 不同条件下经4T1细胞处理后T细胞的细胞因子分泌情况。共孵育后通过 ELISA 检测上清液中的细胞因子水平。误差线代表三次生物学重复实验的标准偏差。统计分析采用双尾t检验。**P < 0.01。*P < 0.05。(J) 体外受精（IVF）模型中卵母细胞的光触发聚糖标记。卵母细胞在授精后0、2和5小时用 GAOM 光激活，随后进行肼-AF488标记。固定后，样本经LeicaSP8 CLSM 成像，并分析每个卵母细胞的最大横截面。比例尺：25 μm 。(K)体外受精（IVF）后2小时的高分辨率成像。比例尺：7.5 μm 。

图6. 光触发细胞表面聚糖重塑级联反应。(A) 实验流程示意图。(B) A549细胞首先用0.1 mg/mL RgGH33M处理，在冰上照射或不照射紫外光5分钟，孵育20分钟并洗涤。随后用0.02 mg/mL GAOM 处理，冰上照射或不照射紫外光5分钟，孵育20分钟，并用肼基-AF488染色以显示末端Gal/GalNAc。比例尺：25 μm 。细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色信号）。

图7。(A)实验流程示意图。(B)体内糖编辑后皮下肿瘤组织切片的共聚焦荧光显微镜图像。 BALB /c小鼠经瘤内注射 GAOM 和 UCNP 后，接受980nm激光照射。肿瘤组织经解剖后冷冻切片，依次与生物素-酰肼和链霉亲和素-AF647孵育。细胞核通过Hoechst33342染色显示（蓝色信号）。比例尺：10 μm。

总体结论

GLOBE平台通过光笼UAA的位点特异性引入，为细胞表面聚糖的时空精准编辑提供了模块化框架：

技术突破：实现了糖酶的光控激活（如GAO、唾液酸酶RgGH33），结合适配体靶向可实现蛋白质选择性编辑，并通过UCNPs辅助实现体内深层组织应用 。

应用价值：可用于研究聚糖动态（如受精过程中卵母细胞表面聚糖重塑）、调控细胞-细胞相互作用（如T细胞-肿瘤细胞结合），并为疾病治疗（如光控前药释放）提供新思路 。

局限性与展望：光笼位点选择依赖结构设计，紫外光穿透限制仍需改进；未来可通过AI辅助位点预测、长波长光笼开发及纳米载体递送，进一步拓展其在基础研究与临床中的应用 。

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