【IF=11.4】南京大学医学院顾宁/朱玉敏团队:多组学揭秘邻苯二甲酸酯通过ARF6-铁死亡-EMT轴促子宫内膜异位症新机制

中文标题：邻苯二甲酸盐暴露促进子宫内膜异位症的机制研究：基于铁磷灭症的视角

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

发表时间：2026年4月

影响因子：11.3/Q1

核心问题：邻苯二甲酸酯（PAEs）作为典型环境内分泌干扰物，流行病学已证实其与子宫内膜异位症（EM）风险相关，但PAEs如何通过铁死亡（ferroptosis）和上皮-间质转化（EMT）驱动EM进展的微观机制尚未明确。

1.1 PAEs的暴露与危害

来源与迁移：PAEs是工业塑化剂，因与聚合物无稳定共价键，易从塑料制品中释放至空气、水、土壤（大气浓度0.004-33,851 ng·m⁻³，水体0.01-71,980 ng·L⁻¹，土壤0.001-820 mg·kg⁻¹）。

人体暴露：通过吸入、食入、皮肤接触累积，具有生殖毒性，尤其损害女性生殖健康（如干扰卵巢激素合成、损伤卵母细胞）。

1.2 EM的病理特征与负担

定义：子宫内膜样组织在宫腔外异常植入，症状包括慢性盆腔痛、进行性痛经、不孕等。

负担：全球患者年均医疗成本近£10,000，亟需深入病理机制研究。

1.3 铁死亡与EM的关联

铁死亡的作用：EM异位内膜组织中脂质过氧化产物和铁死亡相关基因（FRGs）显著升高，铁死亡通过促进异位细胞异常存活增殖参与EM发病。

研究空白：PAEs暴露、铁死亡与EM三者的交互机制不明，尤其是PAEs是否通过调控铁死亡通路介导“PAEs-EM”轴。

本研究整合多组学分析、机器学习、分子模拟与临床验证，系统探究PAEs促EM的机制，具体方法如下：

2.1 数据与靶点收集

PAEs成分：从PubMed等数据库获取7种常见PAEs（DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP、DiNP、DOP）。

靶点来源：

PAEs相关靶点：ChEMBL、CTD、PharmMapper、Swiss Target Prediction（5325个）；

EM相关靶点：GeneCards、TTD、DrugBank、OMIM（2440个）；

FRGs：FerrDb数据库（471个）。

2.2 多组学数据处理

Bulk RNA-seq：GEO数据库获取GSE51981（训练集，71正常+77 EM样本）、GSE7305/GSE7846（验证集），limma包分析差异表达基因（DEGs），WGCNA识别EM相关共表达模块（turquoise模块，2215个基因）。

scRNA-seq：Tan等研究的6个EM样本，Seurat包过滤低质量细胞（线粒体基因<20%、nFeature RNA 200-6000），UMAP降维，注释7种细胞类型（上皮细胞Epi、间质细胞MSCs等）。

空间转录组：GSM6690476数据集，Seurat+SCTransform归一化，RCTD反卷积解析细胞类型空间分布。

2.3 生物信息学分析

功能富集：clusterProfiler包GO/KEGG分析（P<0.05），ggplot2可视化。

机器学习：12种算法（82个框架）筛选关键FRG，XGBoost+Lasso+RF组合最优（平均C-index最高），识别共同候选基因ARF6。

免疫细胞浸润：ssGSEA评估28种免疫细胞（TISIDB数据库），Wilcoxon检验比较组间差异。

2.4 机制验证实验

单细胞分析：CytoTRACE评估Epi干性，GSVA分析MSCs的EMT特征，Monocle2伪时间轨迹分析细胞转化。

ARF6功能模拟：scTenifoldKnk算法构建基因调控网络（GRN），虚拟敲除ARF6分析下游FRGs扰动。

分子对接：AutoDock Vina模拟PAEs与ARF6（PDB ID:2A5D）结合，PyMOL可视化互作。

临床样本验证：10例EM患者/非EM对照的子宫内膜组织，IHC（ARF6抗体）、IF（ARF6与EMT标志物共定位）检测表达。

图1 本研究分析流程图

3.1 识别PAEs暴露下EM中差异表达的FRGs

流程与交集：PAE-EM预测靶点929个（Fig.2A），GSE51981的DEGs 2370个（Fig.2B-C），WGCNA识别turquoise模块（Fig.2D），交集得2215个EM相关DEGs（Fig.2E），与FRGs重叠得10个PAEs/EM-FRGs（TFAM、TGFB1、ARF6、EZH2等，Fig.2F-G）。

3.2 PAEs/EM-FRGs富集于氧化应激和EMT通路

功能富集：GO分析显示其参与“响应活性氧”“EMT正调控”等（Fig.2I）；KEGG分析关联“铁死亡”“子宫内膜癌”等通路（Fig.2J）。

图2 PAES/EM-FRGs的鉴定

3.3 ARF6是PAEs暴露下的关键FRG

机器学习筛选：XGBoost+Lasso+RF组合从10个FRGs中识别ARF6（所有算法共同指向，Fig.3A-E）。

实验验证：IHC/IF显示EM组织中ARF6表达显著高于对照（Fig.3F-I）。

图3 使用多种机器学习算法识别暴露于PAEs的集线器FRG

3.4 ARF6影响EM免疫微环境

免疫细胞浸润：ssGSEA分析发现15种免疫细胞（T/B细胞、巨噬细胞等）在EM中浸润紊乱，ARF6表达与这些细胞丰度显著相关（Figure S2）。

3.5 ARF6与EM中EMT相关细胞共定位

单细胞表达：scRNA-seq聚类19个细胞簇（Fig.4A），注释Epi（对照组富集）、MSCs（EM组富集）（Fig.4D-E），ARF6在Epi和MSCs中均有表达（Fig.4F）。

共定位验证：IF显示对照组ARF6与EPCAM（Epi标记）低表达共定位，EM组与COL1A1（MSCs标记）高表达共定位（Fig.4G）。

图4 单细胞转录组图谱

3.6 ARF6表达与Epi干性正相关

Epi亚型分析：Epi分SOX9、Lumenal、Glandular、Ciliated亚型（Fig.5A-B），Lumenal/Ciliated在对照组为主（Fig.5C-D），ARF6在Lumenal/Glandular高表达（Fig.5E-G）。

干性关联：CytoTRACE分析显示Lumenal/Ciliated干性最高（Fig.5H-I），ARF6表达与两者干性显著正相关（Fig.5J-K）。

图5 EPI亚型的注释和细胞追踪分析

3.7 MSCs中Fibros亚型的EMT能力强

MSCs亚型：分EnS、Fibros、SMCs（Fig.6A-B），Fibros在EM组富集（Fig.6C-D），ARF6在Fibros高表达（Fig.6E-F）。

EMT能力：GSVA分析显示Fibros的EMT特征最显著（Fig.6G）。

图6 MSC亚型的注释和GSVA分析

3.8 ARF6介导EMT促进Fibros分化

伪时间轨迹：对照组Lumenal/Ciliated向EM组Fibros转化（Fig.7A-G），ARF6表达与Fibros的EMT分化水平（CDH2/SNAI1）正相关（Fig.7H-K）。

蛋白共定位：IF显示ARF6与CDH2（间质标记）在EM中共定位（Fig.7L）。

图7 EPI/MSC亚型的伪时间分析

3.9 空间转录组结合IF验证EM中EMT

空间特征：空间转录组显示EM组织异质性（Fig.8A-B），RCTD反卷积注释EMT细胞（Fig.8C-D），ARF6在EMT细胞中高表达（Fig.8E）。

分子机制：对照组ARF6与CDH1（上皮标记）共定位（Fig.8F），IL6信号在Lumenal+Ciliated与Fibros间显著（Fig.8J），空间距离两者最近（Fig.8K），伪时间分析支持转化（Fig.8L）。

图8 空间转录组学和免疫荧光共定位揭示了ARF6介导的EM中上皮-间质转化的空间分子机制

3.10 ARF6虚拟敲除揭示铁死亡调控网络

扰动效应：scTenifoldKnk模拟ARF6敲除，23个FRGs扰动（Figure S5），富集于“氧化应激响应”“蛋白磷酸化调控”等（Fig.9A）。

3.11 PAEs与ARF6的分子对接

结合能力：PAEs与ARF6结合能<-5 kcal/mol（优秀亲和力），存在氢键和范德华力（Fig.9B-I）。

图9 利用模拟敲除和分子对接揭示ARF6促进EM的潜在机制

4.1 核心结论

关键分子：ARF6是PAEs暴露下促EM的关键FRG，通过调控铁死亡和EMT驱动EM进展。

EMT模型：构建“Lumenal+Ciliated（Epi）→Fibros（MSCs）”的特异性EMT转化模型，突破传统“混合细胞群体”研究的局限。

致病轴：提出“PAEs-铁死亡-EMT-EM”轴，阐明PAEs通过上调ARF6表达，增强Epi干性、促进EMT转化、扰动铁死亡通路，最终破坏免疫微环境促EM。

4.2 意义与展望

临床价值：ARF6可作为EM的新型治疗靶点（如靶向抑制ARF6表达）。

公共卫生：强调控制PAEs暴露（如减少塑料用品使用）对EM预防的重要性。

局限与未来：需扩展多组学维度（ATAC-seq、ChIP-seq）、开展体内外实验验证ARF6的具体调控机制。

后续协助方向：是否需要我帮你进一步解析该研究中某部分实验设计的细节（如scTenifoldKnk算法的虚拟敲除原理），或整理关键基因（如ARF6、FRGs）的功能列表？