南京农大动物医学院 闫丽萍,田一辰等:鸥源H13N3和H13N6亚型禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

 研究背景与目的

禽流感病毒（AIV）可随候鸟迁徙全球传播，对动物与公共卫生安全构成潜在威胁。H13亚型AIV自1977年首次从北美鸥类分离以来，主要局限于水禽宿主，但近年在家禽和哺乳动物中偶有检出，提示其存在跨物种传播风险。本研究于2022年监测江苏省迁徙水鸟AIV流行情况期间，从盐城湿地红嘴鸥粪便样本中首次分离获得两株H13亚型AIV（H13N3和H13N6），系江苏省首次报道。通过全基因组测序、遗传演化分析及生物学特性研究，探究其基因来源、分子特征及跨物种传播风险，为我国禽流感溯源监测及防控策略提供重要参考。

1　材料与方法

1.1　样品采集

2021年12月—2022年12月，江苏省盐城市采集野生水鸟新鲜粪便2483份，拭子采集后置于含青链霉素和10%甘油的保存液中，4°C冷藏运输，-80°C保存。

1.2　主要试验材料

SPF鸡胚、4周龄BALB/c小鼠；细胞系：A549（人肺泡基底上皮细胞）、MDCK（犬肾细胞）、DF-1（鸡胚成纤维细胞）；主要试剂：Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase、总核酸快速提取试剂盒、RNA反转录试剂盒等。

1.3　病毒分离鉴定与纯化

qRT-PCR检测M基因确认AIV阳性；阳性样品接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，37°C培养72h；血凝试验收集阳性尿囊液，有限稀释法纯化病毒（10⁻⁴~10⁻⁹稀释，连续三代）。

1.4　全基因组测序与系统发育分析

总核酸提取，Uni-12引物反转录为cDNA；Hoffmann通用引物（表1）扩增8个基因片段；TOPO克隆载体连接，测序；DNAStar SeqMan拼接，MegAlign氨基酸位点分析；NCBI BLAST比对，MEGA11最大似然法（ML）构建演化树，GTR+G+I模型，Bootstrap 1000次。

1.5　病毒鸡胚半数感染量（EID₅₀）的滴定

病毒液加1%双抗，4°C作用4h；10倍倍比稀释（10⁻¹~10⁻⁹），每个稀释度接种5枚9日龄SPF胚；Reed-Muench法计算EID₅₀。

1.6　受体结合试验

重唾液酸化红细胞法检测受体结合特性，α-2,3唾液酸酶处理鸡红细胞（仅含α-2,6受体）；霍乱弧菌神经氨酸酶（VCNA）处理（不含禽型及人型受体）；1%红细胞悬浮液进行血凝试验；对照：PR8/H1N1（仅结合人型受体）、A690/H7N3（仅结合禽型受体）。

1.7　病毒在哺乳动物源及禽源细胞生长曲线的测定

MOI=0.01接种DF-1、MDCK、A549细胞，1.5h后弃去，PBS冲洗3次，加入含TPCK胰酶（2μg·mL⁻¹）的维持培养基，感染后12、24、48、72h收取上清液，SPF鸡胚测定病毒滴度。

1.8　小鼠致病力试验

27只4周龄BALB/c小鼠随机分3组（每组9只）；鼻腔接种10⁶·⁰EID₅₀病毒液或50μL PBS，持续观察14d，每日称量体重，3dpi和5dpi各取3只安乐死，采集肺、鼻甲骨、肝、肾、肠、脑，组织研磨后10倍倍比稀释，接种SPF鸡胚测定病毒滴度。

1.9　雏鸡致病力试验

18只3日龄SPF雏鸡及18只10日龄SPF雏鸡，随机分6组（每组6只）；鼻腔接种10⁶·⁰EID₅₀病毒液或100μL PBS；3dpi各取3只安乐死，采集气管、心、肝、肺、肾、胸腺、肠测定病毒滴度；剩余雏鸡观察至14d，静脉采血分离血清，HI试验检测抗体水平。

1.10　统计学分析

GraphPad Prism 8.0软件；正态性和对数正态性检验，双因素方差分析（ANOVA）；判定标准：*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001, ****.P<0.0001；三次独立重复试验。

2　结果

2.1　病毒分离鉴定与全基因组测序 

2021年12月—2022年12月共检测野鸟粪便拭子2483份，AIV核酸阳性26份，阳性率1.04%。从2022年12月红嘴鸥新鲜粪便中分离出2株H13亚型AIV：F463/H13N3和F481/H13N6。PCR扩增8个基因片段，条带大小与预期一致。BLAST分析显示，两株病毒HA基因均与格鲁吉亚2017年家鸡分离株相似性最高（96.33%和96.50%）；F463/H13N3的NA基因与2019年中国台北家鸭源H5N3相似性最高（98.56%）；F481/H13N6的NA基因与2020年美国阿拉斯加灰翅鸥源H13N6相似性最高（97.61%）。其余内部基因与荷兰、格鲁吉亚、阿拉斯加和韩国等地H13或H16亚型AIV相似性最高（图1）。

2.2　重要氨基酸位点分析 

两株病毒HA裂解位点均为ISNR↓GLF，无连续碱性氨基酸插入，符合低致病性AIV特征。HA蛋白228位点发生G228S突变，可能增强与人型受体结合能力。内部基因中，PB2蛋白存在R477G和I495V突变、PB1蛋白L473V突变、M1蛋白N30D和T215A突变、NS1蛋白L103F和I106M突变，均与哺乳动物适应性相关。未发现耐药性相关分子标记（表2）。

2.3　两株H13亚型AIV全基因组序列遗传演化分析

2.3.1　HA基因遗传演化分析 

H13亚型毒株可分为三个独立谱系。本研究两株分离株与2021年韩国分离毒株A/Vega gull/South Korea/GNU54/2021(H13N6)亲缘关系最近，共同聚集于Group I。与2016年中国威海分离株和2013年大连分离株核苷酸相似性为91.7%~95.0%，与野鸭等雁形目宿主分离株演化距离较远，谱系特异性明显（图2）。

2.3.2　NA基因遗传演化分析 

F463/H13N3株NA基因属于欧亚分支，与2019年蒙古家鸭源H5N3分离株亲缘关系最近，表明其NA基因可能来源于鸭源H5N3亚型AIV。F481/H13N6株NA基因与2020年美国阿拉斯加灰翅鸥源H13N6同源性最高，与鸥源H13N6亚型亲缘关系近，与其他亚型N6距离较远，表现出相对独立的演化特征（图3、4）。

2.3.3　内部基因遗传演化分析 

两株病毒内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）核苷酸相似性为95.1%~100%，均属于欧亚分支，与鸥源H13亚型分离毒株亲缘关系近。F481/H13N6的PB1基因与2014年格鲁吉亚家鸡源分离株高度同源，提示可能存在鸥与家禽间基因交流。NP、M基因与2020年美国阿拉斯加灰翅鸥源分离株密切相关，提示跨洲际传播。NS基因与2023年瑞士赤狐源H5N1分离株亲缘关系较近，表明可能参与H5N1亚型毒株的基因重配（图5）。

2.4　鸥源H13亚型AIV的受体结合特性 

两株H13亚型AIV均展示对α-2,6唾液酸受体和α-2,3唾液酸受体的双结合特性，但与α-2,3唾液酸受体结合能力更强。PR8/H1N1仅结合人型受体，A690/H7N3仅结合禽型受体，验证了对照可靠性。G228S突变使其具备与人型受体结合能力，但仍更倾向于禽型受体（图6）。

2.5　鸥源H13亚型AIV在禽源及哺乳动物源细胞中的生长曲线 

两株病毒均能在DF-1、MDCK、A549三种细胞中有效复制。DF-1细胞中24hpi达峰值，F463/H13N3滴度(3.50±0.20) lg EID₅₀·100μL⁻¹，F481/H13N6滴度(4.17±0.31) lg EID₅₀·100μL⁻¹。MDCK细胞中24hpi达峰值，F463/H13N3滴度(3.78±0.16) lg EID₅₀·100μL⁻¹，F481/H13N6滴度(4.42±0.12) lg EID₅₀·100μL⁻¹。A549细胞中F463/H13N3于24hpi达峰值(4.17±0.47)，F481/H13N6于72hpi达峰值(4.67±0.12)。F481/H13N6在三种细胞中复制滴度均高于F463/H13N39（图7）。

2.6　鸥源H13亚型AIV对BALB/c小鼠致病性试验 

两株病毒毒价分别为10⁷·³⁷EID₅₀·mL⁻¹和10⁷·⁶⁷EID₅₀·mL⁻¹。攻毒小鼠体重未出现显著变化，未见明显临床症状和死亡。3dpi时，仅F463/H13N3感染组小鼠鼻甲骨中检测到病毒（2/3），滴度(1.193±0.141) lg EID₅₀·100μL⁻¹，其余脏器均未检出病毒。5dpi时各脏器均未检测到病毒。表明鸥源H13亚型AIV在哺乳动物宿主中复制能力极低，仅F463/H13N3可在上呼吸道有限复制（图8、9）。

2.7　鸥源H13亚型AIV对SPF雏鸡致病性试验 

感染后各组雏鸡均未出现异常临床症状或死亡。3dpi时各组织病毒滴定均为阴性，表明病毒未能在家禽体内有效复制。F463/H13N3感染3日龄雏鸡14dpi血清中检测到低水平HI抗体（2/3阳性，滴度1∶32），提示该株可能具有有限的感染能力。F481/H13N6感染雏鸡未检测到抗体（图10）。

3　讨论

3.1 分离株的遗传演化特征

本研究分离株基因来源复杂，呈现多宿主来源特征：HA基因源自格鲁吉亚家鸡，F463/H13N3的NA基因来源于家鸭源H5N3，提示发生家禽至鸥的跨宿主重组事件。NS基因与2023年瑞士赤狐源H5N1内部基因关系密切，表明H13亚型AIV可能向哺乳动物适应性H5N1毒株提供内部基因。鸥类的长距离迁徙促进AIV在不同地区间基因流动，被视为不同禽流感谱系的"基因混合器"。

3.2 跨物种传播风险分析

分子特征显示，HA蛋白G228S突变可能增强与人型受体结合能力，受体结合试验证实双受体结合特性。PB2、PB1、M1、NS1蛋白存在多处哺乳动物适应性突变，为跨宿主传播提供分子基础。但体内试验显示，两株病毒在小鼠体内复制能力有限（仅鼻甲骨低滴度），在雏鸡体内未能有效复制，提示尚未获得有效感染哺乳动物和家禽的能力。与文献中致病力较强的Group III分支毒株相比，本研究分离株位于Group I，对雏鸡致病性较低。

3.3 宿主限制机制

H13亚型AIV的NS1和NP蛋白中存在与鸥类宿主限制性相关的特异性氨基酸标记（NP第105-109位VRELV、NS1第90-95位IERILD），本研究两株分离株同样存在这些序列，可能限制其在家禽和哺乳动物中的复制能力。

3.4 防控建议

鉴于鸥类栖息环境与人类活动密切关联及病毒潜在的重组风险，应持续加强江苏地区迁徙水鸟的AIV监测，重点关注H13亚型的分子演化及宿主适应特征。提高沿海地区鸥类监测频率、建立迁徙季节快速检测机制，强化养殖场生物安全措施，阻断野鸟与家禽间传播链。

4　结论

本研究在江苏盐城红嘴鸥粪便样本中首次分离出两株H13亚型AIV（F463/H13N3和F481/H13N6）。遗传演化与分子生物学特性分析表明，分离株呈现低致病性AIV分子特征，各基因片段来源复杂，已发生鸥-家禽间跨宿主重组，部分基因与H5N1毒株亲缘关系密切，并携带多处哺乳动物适应性突变。生物学特性研究显示，分离株可在禽源及哺乳动物细胞中复制，但在小鼠体内复制能力有限，且均无法在雏鸡体内有效复制。综上，江苏省鸥源H13亚型AIV存在跨物种传播的潜在风险，但尚未获得有效感染家禽和哺乳动物的能力。本研究为我国禽流感的监测和防控提供了重要参考。

关键词：禽流感 ; H13亚型 ; 遗传演化 ; 生物学特性