最新!南京大学院长助理&科技部重点研发青年首席&国家高层次人才Nat Commun-细胞工厂与新-to-自然光生物催化融合用于D-高色氨酸的合成

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一、中文标题

微生物细胞工厂与新-to-自然光生物催化相融合用于D-高色氨酸的从头生物合成

二、发表单位及通讯作者

• 发表单位：南京大学化学化工学院、配位化学国家重点实验室；上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室

• 通讯作者：

• 黄小强（Xiaoqiang Huang），huangx513@nju.edu.cn

• 鲁洪中（Hongzhong Lu），hongzhonglu@sjtu.edu.cn

三、科学问题

      如何通过模块化设计将好氧发酵（模块I：微生物细胞工厂生产吲哚-3-乙酸）与厌氧光催化（模块II：光氧化还原/酶催化合成D-高色氨酸）进行空间与功能解耦，克服异源表达对细胞代谢的负担以及好氧/厌氧条件不兼容等挑战，实现非天然氨基酸D-高色氨酸的从头生物合成？

四、发表时间

• 时间：2026年6月11日

• 链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-74128-3

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五、摘要

      微生物细胞工厂是合成高值分子的强大生物工具，但天然酶的内在催化特异性限制了产物多样性。尽管光生物催化扩展了酶的催化能力，但繁琐的酶纯化、与体内条件的不兼容以及复杂非天然底物的合成等挑战阻碍了光生物制造的发展。本研究通过模块化设计将好氧发酵（模块I）与厌氧光催化（模块II）相结合，实现了D-高色氨酸的从头生物合成。在模块I中，通过代谢通量改造和多拷贝基因扩增策略，工程化大肠杆菌生产吲哚-3-乙酸（IAA）。在模块II中，利用吡哆醛磷酸（PLP）依赖的色氨酸合酶β亚基（TrpB）变体，开发了从L-丝氨酸和IAA高效合成D-高色氨酸的光氧化还原/酶催化协同体系。该工作将新兴的光生物催化反应性与天然生物合成相融合，为未来非天然产物的生物制造提供了一个有潜力的平台。

六、研究背景

      微生物细胞工厂因其在可持续、经济和绿色方式中增强天然代谢产物生产或合成高值非天然化合物方面的能力而备受关注。非经典氨基酸（ncAAs）在药物开发、生物材料合成、酶活性位点重塑和蛋白质翻译后修饰中应用日益广泛，通过微生物细胞工厂生产ncAAs是一条具有巨大工业潜力的有吸引力的途径。此前，通过将光催化材料与生物催化整合，已成功开发了光合生物杂化系统，利用细胞代谢将太阳能高效、选择性和可持续地转化为化学产品。然而，当前的MCFs方法主要依赖天然酶和现有生化途径，与化学催化相比，所产生化合物的结构多样性受限。

      非天然光生物催化通过将光催化的多样化反应模式与酶的固有优势协同整合，在扩展酶反应性和C-C键形成以介导关键生化转化和立体选择性功能化方面，开辟了创新范式。近期将重新利用的金属酶整合到微生物代谢网络中的进展，为多样化生物合成可及分子谱开辟了优雅途径。例如，Keasling、Hartwig及其合作者将柠檬烯代谢途径与人工酶整合，实现了胞内Ir-CYP119介导的柠檬烯环丙烷化。最近，他们进一步在体内工程化了血红素依赖的卡宾转移酶，通过工程化遗传簇使修饰菌株内源合成α-重氮氮杂丝氨酸作为卡宾前体，实现了胞内苯乙烯的环丙烷化。

      尽管已有少数基于天然FAP的光酶脱羧与MCFs整合的实例，但非天然光反应性与MCFs的整合仍鲜有探索，主要面临以下挑战：首先，异源表达的非天然光酶和内源代谢网络的调控会加剧代谢负担，损害细胞活力和酶活性；其次，光氧化还原/酶系统通常需要厌氧条件（因为O₂会干扰自由基介导的催化过程），这与好氧微生物细胞工厂存在根本性的整合挑战。本研究开发了一种非天然光生物催化自由基C-C形成反应，并展示了其与微生物系统的整合，建立了光驱动的大肠杆菌实现ncAAs的从头生物合成。

七、研究结果

结果1、光驱动微生物细胞工厂的模块化设计

      为实现D-高色氨酸的从头生物合成，研究采用了三阶段策略：（i）在光照射下，由突变TrpB酶催化IAA和L-丝氨酸体外转化为D-高色氨酸；（ii）通过关键途径改造重定向碳通量，增强模块I中IAA的生产；（iii）通过模块化耦合工程化模块II，建立功能性的光驱动微生物细胞工厂。

图1 技术思路

结果2、非天然光生物催化合成D-高色氨酸

      筛选了5种PLP依赖的TrpB酶，其中来源于激烈火球菌的P/TrpB⁷ᴱ⁶变体效果最佳，在440-450 nm蓝光照射下，以66%的分离产率和96:4的对映体比例（D/L）得到D-高色氨酸。TEMPO自由基捕获实验完全抑制了产物形成，HRMS检测到TEMPO加合物，证实了自由基中间体Int. C的生成。UV-vis光谱显示PLP依赖性酶的λmax（392 nm）不受IAA影响，但加入L-丝氨酸后红移至404 nm，与底物结合一致。分子动力学模拟和CAVER分析表明，P/TrpB⁷ᴱ⁶底物进入通道的最窄处为4.2 Å，而A/TrpB仅为2.4 Å，解释了前者活性更高的原因。筛选光催化剂发现RhB（10 mol%）最佳。底物范围研究表明，带有2-甲基、6-氟或6-氯取代的IAA可被有效转化，产物e.r.分别为98:2、83:17和84:16。用L-苏氨酸替代L-丝氨酸也可与6-氟或6-氯取代的IAA反应，产率21-29%，e.r. 86:14和89:11，d.r. 19:1。

图2 光催化合成

结果3、通过代谢通量改造提高L-色氨酸合成

      为增强IAA生物合成的前体供应，工程化了大肠杆菌的芳香氨基酸代谢：敲除pheA和tyrA将分支酸通量重定向至L-色氨酸；消除L-色氨酸合酶的别构调控；敲除tnaA防止L-色氨酸分解代谢；过表达trpEDCBA增加途径通量。tyrA敲除导致严重的生长缺陷（比生长速率降低70.78%），通过使用生长响应性启动子Pflic在稳定期条件性互补tyrA，生物量恢复2-4倍，同时使色氨酸产量超过500 mg/L。最优菌株MGHT-10-1在分批发酵中色氨酸产量达506.72 mg/L。

图3 代谢重编程

结果4、通过IAM途径和多拷贝基因扩增提高IAA前体产量

      在色氨酸高产菌株MGHT-10-1中系统重构了IAM依赖的IAA生产途径。比较5株工程菌发现，共表达iaam和ami1的菌株MGHT-11积累485.94 mg/L IAM但仅产生21.30 mg/L IAA，且生长严重抑制。表达tms2的菌株MGHT-15使IAA产量提高6.5倍至158.99 mg/L，但残留IAM仍达372.15 mg/L。将ami1或tms2在四个中性位点（mbhA、ldhA、sdaB、poxB）进行多拷贝整合，四拷贝ami1菌株MGHT-18的IAA产量从21.30提升至79.02 mg/L；四拷贝tms2菌株MGHT-21实现471.62 mg/L IAA（较单拷贝提高约2倍），残留IAM降至141.20 mg/L。

图4 代谢优化

结果5、光驱动微生物细胞工厂的构建与优化

      模块I中，通过3 L生物反应器好氧发酵，菌株MGHT-21在60 h内生产IAA 906.13 mg/L，产率18.84 mg/L/h。模块II中，使用发酵来源IAA与商业IAA的D-高色氨酸产量相当（约187 mg/L）。培养基筛选表明M9培养基效果最佳（191.38 mg/L），TB培养基抑制严重（降低38.49%），LB培养基无产物。缓冲能力是关键因素：用磷酸盐缓冲液（9.4 g/L K₂HPO₄ + 2.2 g/L KH₂PO₄）替代LB中的NaCl后，产量恢复至98.04 mg/L。光强优化显示135-180 mW/cm²时产量最高。使用发酵IAA为前体，D-高色氨酸浓度在光照下稳步增加，30 h达到峰值299.75 mg/L（产率1.0 mg产物/g葡萄糖），暗对照无产物。100 mL规模放大实验中，60 h产量达177.6 mg/L。

图5 光驱动微生物细胞工厂

八、讨论

      本研究成功开发了光驱动微生物细胞工厂，通过模块化策略将好氧代谢网络与厌氧光生物催化耦合，实现了非天然氨基酸D-高色氨酸的从头生物合成。P/TrpB⁷ᴱ⁶在光催化剂RhB和蓝光照射下催化IAA与L-丝氨酸的C-C键形成，底物范围可扩展至2-甲基、6-氟、6-氯取代的IAA衍生物，且可用L-苏氨酸替代L-丝氨酸。通过系统性代谢重构（包括色氨酸通量增强、异源IAM途径引入、tms2多拷贝整合），IAA产量达906.13 mg/L。尽管当前D-高色氨酸产量（299.75 mg/L）尚未达到工业化水平（如乙内酰脲酶工艺），但该模块化设计为光驱动微生物细胞工厂建立了一个原型，实现了无外源诱导剂、无抗生素的稳定生产。未来工作将聚焦于构建外排系统以缓解产物抑制导致的生物量下降和IAM周期性积累，以及通过酶和宿主工程、过程强化和放大来评估其工业应用潜力。该研究为工程化生物合成途径生产高值化学品扩展了工具箱。

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