南京农大/扬州大学 王先炜,张杨杨等:NS7基因缺失对猪丁型冠状病毒致病性的影响

 研究背景与目的

猪丁型冠状病毒（PDCoV）是近年来新流行的肠道冠状病毒，可感染各年龄阶段猪，引起仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，临床症状与PEDV、TGEV相似，且常混合感染，给猪肠道腹泻病防控带来巨大困难。PDCoV具有跨物种传播潜力，2021年《Nature》报道在海地儿童血浆中分离出PDCoV毒株，提示其人畜共患风险。冠状病毒辅助蛋白虽不作为病毒粒子主要成分，但对病毒吸附、增殖及逃避宿主天然免疫至关重要。PDCoV辅助蛋白NS6已被证实通过干扰RIG-I/MDA5与dsRNA结合抑制干扰素诱导。NS7蛋白的功能尚不明确，其内部NS7a为干扰素拮抗剂，可通过破坏IKKε与TRAF3和IRF3结合抑制IFNβ产生。本研究旨在利用本实验室构建的基于BAC系统的PDCoV反向遗传平台，通过CRISPR-Cas9技术构建NS7基因缺失重组病毒（rPDCoV-ΔNS7），系统评估NS7缺失对PDCoV体外复制特性及仔猪体内致病力的影响，为PDCoV致病机制研究及疫苗靶点筛选提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　毒株、细胞、质粒及试验动物

毒株： PDCoV JS2021-LX毒株（GenBank: OQ473581.1）；细胞与质粒： LLC-PK1细胞；pBAC-PDCoV反向遗传操作系统。试验动物： PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV抗原抗体阴性仔猪。

1.2　主要试剂

抗体： PDCoV NS7蛋白多克隆抗体；PDCoV N蛋白单克隆抗体；CoraLite 594标记羊抗鼠IgG；羊抗鼠IgG-HRP。试剂盒与工具酶： Lipofectamine 3000（Thermo）；CRISPR-Cas9内切酶、T7体外转录试剂盒（NEB）；RNA提取试剂盒（Omega）；RNA反转录试剂盒、同源重组试剂盒、DNA Marker（诺唯赞）；质粒大提试剂盒（MACHEREY NAGEL）；DH10B感受态细胞（昂羽生物）

1.3　pBAC-PDCoV-ΔNS7重组质粒的构建

策略设计： NS7基因嵌套于N基因开放阅读框内，采用同义突变策略——将NS7基因内所有起始密码子ATG突变为ACG（苏氨酸），实现NS7蛋白功能选择性失活且不改变N基因编码氨基酸序列。

技术路线：gRNA设计：在NS7基因上下游各设计一对gRNA，与scaffold oligo退火形成双链，T7体外转录获得sgRNAΔNS7a和sgRNAΔNS7b；Cas9切割：Cas9内切酶与sgRNA定位切割pBAC-PDCoV载体，去除NS7基因，获得线性化载体；片段扩增：分别扩增NS7-up片段（662 bp）、NS7-down片段（663 bp）及NS7基因突变片段（603 bp）；同源重组：通过overlap PCR融合三个片段，与线性化载体同源重组连接；转化验证：连接产物转化DH10B感受态细胞，单克隆测序验证。

1.4　rPDCoV-ΔNS7病毒的拯救与鉴定

病毒拯救： pBAC-PDCoV-ΔNS7重组质粒转染单层LLC-PK1细胞，10h后换含10 μg·mL⁻¹胰蛋白酶的DMEM维持液培养，待细胞病变（CPE）后冻融离心收集上清（F1代），传代三次。

鉴定方法：间接免疫荧光（IFA）： 检测N蛋白和NS7蛋白表达；Western blot： 验证NS7蛋白缺失及N蛋白表达；RT-PCR测序： F3代验证NS7基因突变，F20代验证遗传稳定性。

1.5　PDCoV、rPDCoV以及rPDCoV-ΔNS7的体外生物学特性比较

生长动力学： 三种病毒均以0.01 MOI接种LLC-PK1细胞，吸附2h后换含8 μg·mL⁻¹胰蛋白酶的维持液，分别于12、24、36、48、60h收取病毒上清测定TCID₅₀，绘制生长曲线。

空斑形态： 同样剂量接种LLC-PK1细胞，2×DMEM与1.8%低熔点琼脂糖1:1覆盖，37 °C培养48 h，结晶紫染色观察空斑大小。

1.6　仔猪致病性试验

分组设计： 4日龄仔猪12头，分4组（对照组、PDCoV组、rPDCoV组、rPDCoV-ΔNS7组），每组3头，口服攻毒，剂量10⁷ TCID₅₀·头⁻¹。

监测指标：每日观察精神状态、食欲、腹泻症状；攻毒24 h后每日采集肛拭子，RT-qPCR检测病毒载量；濒死仔猪立即剖杀，存活仔猪攻毒后第5天统一剖杀；采集心、肝、脾、肺、肾及肠道各段，制备组织悬液检测病毒分布；十二指肠、空肠、回肠固定，HE染色和免疫荧光分析病理变化。

1.7　数据分析

GraphPad 8.0统计分析，one-way ANOVA或two-way ANOVA比较组间差异，P<0.05为显著。

2　结果

2.1　pBAC-PDCoV-ΔNS7重组质粒的构建与鉴定 

gRNA退火产物： 两对gRNA与scaffold oligo退火融合产物大小136 bp，电泳验证正确。载体线性化： pBAC-PDCoV经Cas9酶切后可见31 760和1 911 bp两条带，切割成功。片段扩增： NS7-up（662 bp）、NS7突变片段（603 bp）、NS7-down（663 bp）及overlap融合产物（1 928 bp）大小均符合预期。测序验证： 单克隆测序显示原NS7基因被成功替换为突变序列，ATG→ACG突变位点准确无误（图2）。

2.2　rPDCoV-ΔNS7的拯救与鉴定 

CPE观察： 质粒转染LLC-PK1细胞48 h后出现典型细胞病变。IFA鉴定： rPDCoV-ΔNS7感染组可检测到N蛋白（红色荧光），检测不到NS7蛋白；PDCoV和rPDCoV组N蛋白和NS7蛋白均阳性。Western blot： rPDCoV-ΔNS7组N蛋白表达正常，NS7蛋白缺失；GAPDH内参一致。遗传稳定性： F3代和F20代测序均显示NS7基因突变位点稳定存在，无其他突变发生。结论： 基于BAC系统的NS7基因缺失重组病毒成功构建且遗传稳定（图3）。

2.3　PDCoV、rPDCoV以及rPDCoV-ΔNS7的体外生物学特性比较 

生长动力学： 三种病毒生长曲线均呈先升后降趋势，36 h达复制峰值（均超10⁸ TCID₅₀·mL⁻¹）。rPDCoV-ΔNS7在12和24 h时病毒滴度显著低于PDCoV和rPDCoV（P<0.01），但36h达到峰值后与两组无统计学差异（P>0.05）。空斑形态： 三种病毒在LLC-PK1上形成的空斑大小无明显差异。分析： NS7缺失导致病毒早期复制延迟，但后期可补偿至正常水平，提示NS7可能参与早期免疫逃逸而非病毒复制必需（图4）。

2.4　仔猪致病性试验分析 

临床症状： 三组攻毒仔猪24 h后均出现精神沉郁、食欲下降，40 h左右个别出现腹泻，96 h症状减轻；对照组正常。三组临床症状无差异。病理剖检： 三组仔猪均见小肠胀气、肠壁变薄，以空肠病变最明显，组间无差异。排毒监测： 肛拭子RT-qPCR显示三组仔猪排毒水平无统计学差异（P>0.05），24 h可检出病毒，随感染时间延长载量增加。组织嗜性： 心、肝、脾、肺、肾及各段肠道均能检测到病毒，空肠病毒载量最高，三组组织内病毒分布无显著差异。病理切片：HE染色： 三组仔猪十二指肠、空肠、回肠均出现肠绒毛变短、萎缩甚至断裂，与对照组差异明显，组间无差异。免疫荧光： 病毒抗原信号主要分布在空肠，回肠次之，十二指肠最少，三组荧光信号强度无明显差异（图5、6）。

3 讨论

反向遗传系统比较： BAC系统在大肠杆菌中操作，避免大量活病毒体外操作，降低实验室感染风险，基因编辑更精准，拯救病毒更接近自然感染状态。与Zhang等（2021）体外连接转录RNA拯救方法相比，本研究BAC系统拯救的rPDCoV-ΔNS7在12和24 h病毒滴度显著降低，而Zhang等报道NS7缺失不影响增殖效果。差异可能源于：①BAC系统通过细菌繁殖保证全长基因组完整性；②体外转录RNA可能引发更强炎症反应，激活宿主修复机制部分补偿基因缺失影响。

NS7功能定位： NS7a作为干扰素拮抗剂，通过破坏IKKε-TRAF3-IRF3复合物抑制IFNβ产生。rPDCoV-ΔNS7早期复制延迟可能与NS7蛋白免疫调控功能缺失相关，宿主早期先天免疫应答增强抑制病毒复制；36 h后病毒滴度恢复，提示存在其他免疫逃逸机制补偿或宿主免疫应答衰减。

疫苗靶点评估： NS7基因缺失不影响病毒最终复制水平和致病性，表明NS7不是PDCoV复制的必需基因，也非重要毒力基因，不适合作为基因缺失弱毒疫苗的靶基因。但NS7对宿主免疫应答的调控效应尚需通过系统性免疫试验进一步阐明。

研究展望： 综合评估NS7缺失重组病毒对宿主天然免疫及适应性免疫应答的影响，有助于明确NS7在病毒免疫逃逸中的潜在功能，为PDCoV防控策略优化提供新思路。

4　结论

1） 基于BAC-CRISPR/Cas9系统成功拯救PDCoV JS2021-LX毒株NS7基因缺失重组病毒（rPDCoV-ΔNS7），遗传稳定性良好（F20代验证）。2） NS7缺失导致病毒早期复制延迟（12、24 h滴度显著降低），但36 h后恢复至正常水平，空斑形态无差异。3） NS7缺失不影响仔猪临床症状、病理损伤、排毒规律及组织嗜性，与亲本病毒和野生型拯救病毒无显著差异。4） NS7不是PDCoV复制必需基因和重要毒力基因，不适合作为弱毒疫苗靶点；但其免疫调控功能值得深入研究。

关键词：PDCoV ; 感染性克隆 ; 基因缺失 ; 攻毒试验 ; 反向遗传