盐胁迫是全球限制作物生产的主要非生物逆境之一，其诱导的活性氧过量积累会引发细胞氧化损伤，严重制约水稻产量和品质提升。硫化氢（H₂S）作为植物中关键的气体信号分子，通过介导蛋白半胱氨酸残基的过硫化翻译后修饰参与胁迫响应，但此前植物中缺乏位点分辨率的全蛋白组过硫化修饰图谱，其调控代谢重编程和耐盐性的分子机制尚不清楚。
2026年7月21日，《PNAS》在线发表了南京林业大学谢彦杰教授团队联合比利时根特大学Frank Van Breusegem教授、黄晶晶研究员团队题为“H2S-mediated protein persulfidation regulates redox metabolic flux underlying salt-stress resilience in rice”的研究论文。该研究采用N-乙基马来酰亚胺-生物素标记的高精度蛋白质组学策略，绘制了水稻叶片在盐胁迫下1691个过硫化半胱氨酸位点的动态修饰图谱，揭示了H₂S通过双重机制协同调控氧化还原稳态的新通路：一方面通过过硫化抑制非氧化磷酸戊糖途径关键酶活性，重定向碳流促进还原力NADPH生成；另一方面通过过硫化修饰保护抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环关键酶MDHAR免受氧化损伤，维持活性氧清除能力。该研究不仅为水稻耐盐分子育种提供了全新功能靶点，也为植物氧化还原调控研究提供了宝贵的位点特异性过硫化组资源。
▎1. 水稻盐胁迫下位点特异性过硫化组图谱的构建与动态分析
研究首先检测到水稻叶片内源性H₂S含量在150 mM NaCl处理后3 h达到峰值，提示过硫化修饰存在盐胁迫响应的动态调控。采用NM-生物素标记联合数据非依赖采集（DIA）蛋白质组学技术，对盐处理0、1、3、6、12 h的水稻叶片进行分析，共鉴定到1122个蛋白上的1691个过硫化半胱氨酸位点，其中713个蛋白为首次报道的植物过硫化修饰靶标，显著扩展了植物过硫化组的资源库。亚细胞定位分析显示过硫化蛋白主要分布于细胞质（46.44%）、叶绿体（19.08%）、线粒体（8.09%）等细胞器，与已有研究的分布模式一致。
动态定量分析表明，随着盐胁迫时间延长，过硫化水平整体呈下降趋势，且该动态变化与对应蛋白的丰度变化无显著相关性，提示过硫化是独立于蛋白表达调控的胁迫响应层。主成分分析显示盐处理3 h后过硫化组开始与对照组显著分离，6-12 h差异进一步扩大；仅8个肽段的过硫化水平在所有胁迫时间点均显著变化，且对应蛋白丰度保持稳定，表明过硫化修饰具有高度的时序特异性和位点特异性调控特征。
图1 水稻盐胁迫下位点特异性过硫化组图谱构建与动态分析
▎2. 过硫化修饰富集于核心代谢通路，靶向磷酸戊糖途径保守半胱氨酸位点
功能富集分析显示，过硫化蛋白显著富集于碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径（PPP）等核心代谢通路；分子功能层面显著富集于金属离子结合、NAD/NADP辅因子结合等类别；结构域分析发现过硫化位点显著富集于金属依赖催化、氧化还原代谢相关结构域，包括蛋白激酶、血红素过氧化物酶家族、NAD(P)依赖氧化还原酶等，提示过硫化修饰广泛调控代谢和氧化还原相关过程。
跨物种比较分析显示，水稻过硫化位点与人类、小鼠的保守位点共61个，这些保守位点所在蛋白显著富集于核糖体和PPP通路。其中PPP关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的Cys158、果糖二磷酸醛缩酶FBA1/3的Cys173等位点在不同物种中高度保守，分子动力学模拟显示OsG6PD的Cys158过硫化可促进NADP+结合口袋开放，增强辅因子亲和力，与此前拟南芥和番茄中的研究结论一致，提示该调控机制在物种间具有保守性。
进一步分析非氧化PPP相关酶的过硫化动态，发现核糖-5-磷酸异构酶（RPI）、转醛醇酶（TAL）、转酮醇酶（TKT）等酶的关键半胱氨酸位点在盐胁迫早期过硫化水平显著上升，体外过硫化实验证实这些重组蛋白均可发生过硫化修饰。分子动力学模拟显示这些位点的过硫化会通过改变底物结合口袋构象、破坏催化氢键相互作用等方式抑制酶活，提示非氧化PPP的过硫化修饰可能重定向碳流至氧化PPP分支，增加NADPH生成以响应氧化胁迫。
图2 过硫化组功能富集分析及磷酸戊糖途径靶标位点验证
▎3. RPI过硫化抑制酶活，重定向碳流促进NADPH生成
以非氧化PPP关键酶RPI为核心开展功能验证，该酶催化核糖-5-磷酸（R5P）与核酮糖-5-磷酸（Ru5P）的可逆互作，是非氧化PPP的关键节点。体内过硫化分析显示，RPI的过硫化水平在盐处理1 h显著升高，随后逐渐下降，与蛋白质组定量结果一致。位点突变实验证实RPI的Cys163和Cys176是主要的过硫化位点，双位点Cys→Ser突变可完全消除其过硫化修饰。酶活实验显示，NaHS（H₂S供体）处理可使野生型RPI活性降低约40%，而双位点突变体酶活不受NaHS影响；分子动力学模拟显示Cys163/176过硫化会破坏底物结合关键氨基酸的氢键相互作用，损害底物定位与催化效率，证实过硫化对RPI活性的抑制效应。
利用H₂S合成关键酶L-半胱氨酸脱硫酶1（LCD1）的敲除突变体lcd1和过表达株系OE-LCD1进行生理验证，发现lcd1突变体对盐胁迫更敏感，而OE-LCD1株系耐盐性显著增强，表明内源H₂S正调控水稻耐盐性。代谢物分析显示，盐胁迫下OE-LCD1株系中Ru5P、FAD和NADPH含量显著高于野生型，而lcd1突变体中上述代谢物含量更低，NADP+含量无显著变化，提示NADPH/NADP+比值升高。上述结果表明，H₂S介导的RPI过硫化作为代谢开关，瞬时抑制非氧化PPP活性，将碳流重定向至氧化PPP分支，维持NADPH生成以增强氧化还原缓冲能力。
图3 过硫化介导非氧化磷酸戊糖途径抑制调控碳流与NADPH生成
▎4. MDHAR过硫化修饰维持AsA-GSH循环稳态，增强ROS清除能力
进一步分析过硫化修饰对NADPH依赖型抗氧化酶的调控，发现AsA-GSH循环关键酶胞质单脱氢抗坏血酸还原酶3（MDHAR3）、叶绿体MDHAR5均存在过硫化修饰位点，其中MDHAR3的Cys70和MDHAR5的Cys119为核心修饰位点。体内动态分析显示，盐胁迫下MDHAR5的过硫化水平在1 h瞬时升高，而MDHAR3的过硫化水平随处理时间延长逐渐下降，且该动态依赖于内源H₂S含量，提示存在亚细胞特异性的调控模式。
酶活实验显示，H₂O₂处理会显著抑制MDHAR3和MDHAR5的活性，而NaHS预处理可显著缓解这种抑制效应，Cys位点突变会削弱NaHS的保护作用。细胞-free降解实验表明，H₂O₂会加速MDHAR蛋白的降解，而NaHS预处理可显著增强其蛋白稳定性。分子动力学模拟显示，Cys位点过硫化可维持MDHAR的催化构象稳定，避免不可逆过氧化导致的辅因子结合破坏，从结构层面解释了过硫化的保护效应。
体内生理指标检测显示，盐胁迫下OE-LCD1株系中MDHAR、DHAR、GR活性及GSH/GSSG比值均显著高于野生型，而lcd1突变体中上述指标更低，表明H₂S介导的MDHAR过硫化可保护其免受氧化损伤，维持AsA-GSH循环的ROS清除能力。
图4 H₂S介导MDHAR过硫化维持抗坏血酸-谷胱甘肽循环稳态
▎5. H₂S介导过硫化调控水稻耐盐的双重分子机制模型
基于上述研究结果，团队提出了完整的调控模型：盐胁迫诱导水稻内源H₂S积累，一方面通过过硫化修饰抑制非氧化PPP关键酶（如RPI）活性，减少碳流进入核苷酸合成等途径，将更多碳流重定向至氧化PPP分支，促进还原力NADPH的生成；另一方面通过过硫化修饰保护AsA-GSH循环关键酶MDHAR免受过氧化和降解，利用生成的NADPH维持AsA-GSH循环的高效运转，清除过量活性氧，最终维持细胞氧化还原稳态，增强水稻的盐胁迫抗性。
图5 H₂S介导蛋白过硫化调控水稻盐胁迫抗性的工作模型
本研究首次在水稻中系统绘制了盐胁迫响应的位点特异性蛋白过硫化动态图谱，揭示了H₂S信号通过翻译后修饰协调还原力生成与抗氧化系统运转的全新调控范式，填补了过硫化修饰调控代谢重编程的机制空白。研究发现的RPI、MDHAR等关键靶点为水稻耐盐分子设计育种提供了新的改造方向，生成的全蛋白组过硫化位点资源也为后续植物氧化还原调控的全局研究奠定了重要数据基础。未来可通过精准编辑过硫化位点验证其育种应用价值，进一步探索该调控模块在小麦、玉米等主粮作物中的保守性，为广适性抗逆作物培育提供通用的理论支撑。
---原文链接---：https://doi.org/10.1073/pnas.2608150123
为了能更有效地帮助广大的科研工作者获取相关信息，植物生物技术Pbj特建立微信群，PlantBiotechnologyJournal投稿以及文献相关问题、公众号发布内容及公众号投稿问题都会集中在群内进行解答，同时鼓励在群内交流学术、碰撞思维。为了保证群内良好的讨论环境，请先添加小编微信，扫描二维码添加，之后我们会及时邀请您进群。小提示：添加小编微信时及进群后请备注学校或单位+姓名，PI在结尾注明，我们会邀请您进入PI群。
