《畜牧兽医学报》2025年第56卷第1期刊登了南京农业大学动物医学院黄心河, 李浩楠, 周潇, 徐佳婧, 张源淑, 韩正康的文章——“植物雌激素大豆黄酮对小鼠乳腺上皮细胞乳成分合成和细胞增殖的影响及机制”，该文由国家自然科学基金(31972640)资助。本研究的创新点在于首次系统地探讨了植物雌激素大豆黄酮（DZ）对小鼠乳腺上皮细胞乳成分合成和细胞增殖的调控作用，并揭示了其通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路发挥作用的潜在机制。这一发现为开发植物雌激素在乳用动物生产中的应用提供了新的理论依据。研究背景
乳腺是哺乳动物乳汁合成和分泌的场所，乳汁的主要成分包括乳糖、乳蛋白和乳脂，这些成分的合成和分泌对幼崽的生长发育至关重要。乳腺上皮细胞（MECs）是乳汁合成的关键细胞类型，其数量和分泌活性直接影响泌乳量。雌激素已被证明能够通过调节多种信号通路促进乳腺发育和乳汁合成，但由于其潜在的毒副作用，寻找替代品成为研究热点。植物雌激素大豆黄酮（DZ）是一种具有类似雌激素活性的化合物，能够与雌激素受体结合，发挥雌激素样作用。然而，关于DZ对乳腺上皮细胞乳成分合成及细胞增殖的影响及其机制的研究仍较少。
研究目的
本研究旨在探讨植物雌激素大豆黄酮（DZ）对小鼠乳腺上皮细胞EpH4-Ev乳成分合成（乳糖、乳蛋白、乳脂肪）及细胞增殖的影响，并初步揭示其作用机制，为DZ在乳用动物生产中的应用提供理论依据。
1 方法
细胞培养与处理：使用小鼠乳腺上皮细胞EpH4-Ev，分为对照组（0 μmol·L-1 DZ）、低浓度组（10 μmol·L-1 DZ）、中浓度组（20 μmol·L-1 DZ）和高浓度组（40 μmol·L-1 DZ），并以雌二醇（E2）作为阳性对照组。细胞在37℃、5% CO₂条件下培养12 h。
细胞活力检测：采用CCK-8法检测不同浓度DZ对细胞活力的影响，确定最佳作用浓度和时间。
乳成分及相关指标检测：通过试剂盒测定细胞及分泌上清中的甘油三酯（TG）和葡萄糖（GLU）含量；利用尼罗红染色观察脂滴合成；采用Western blot检测乳成分合成相关蛋白及细胞增殖与凋亡相关蛋白的表达；通过流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡率。
信号通路检测：检测PI3K/AKT-mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化水平。
2 结果
2.1 DZ对细胞活力的影响
2.5~80μmol·L-1 DZ处理显著提高细胞活力（P<0.01），其中20 μmol·L-1 DZ效果最显著，而48 h处理则显著降低细胞活力。因此，选择10、20和40 μmol·L-1作为后续试验的低、中、高浓度，处理时间为12 h(图1）。
2.2DZ对甘油三酯含量的影响
中浓度和高浓度DZ显著提高细胞及分泌上清中的甘油三酯含量（P<0.01），表明DZ促进了脂滴的合成（图2）。
DZ处理显著提高细胞及分泌上清中的葡萄糖含量（P<0.01），且呈剂量依赖性（图3）。DZ处理显著增加细胞中脂滴的亮度和含量（P<0.01），表明DZ促进了乳脂的合成（图4）。2.5 DZ对乳成分合成相关蛋白表达的影响
DZ显著上调了葡萄糖转运载体1（GLUT1）、β-酪蛋白（β-casein）、脂肪酸合成酶（FASN）、胆固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的表达，表明DZ促进了乳糖、乳蛋白和乳脂的合成（图5）。
DZ处理显著增加了G2/M期和S期细胞比例，降低了G0/G1期细胞比例，表明DZ促进了细胞增殖（图6）中浓度DZ显著降低了细胞凋亡率，而高浓度DZ则显著提高了凋亡率（图7）。2.8 DZ对增殖与凋亡相关蛋白表达的影响
DZ显著上调了增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白D1和D3、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时中浓度DZ显著增加了Bcl-2/Bax比值，降低了细胞凋亡率（图8）。
2.9 DZ对PI3K/AKT-mTOR信号通路的影响
DZ显著增加了p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的磷酸化水平，表明DZ通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路促进细胞增殖和乳成分合成（图9）。3 讨论
3.1 DZ对细胞增殖与凋亡的影响
DZ通过上调细胞周期蛋白D1、D3和PCNA的表达，增加G2/M期和S期细胞比例，促进细胞增殖。同时，中浓度DZ通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，降低凋亡率，维持细胞存活。
3.2 DZ对乳成分合成的影响
DZ通过促进GLUT1的表达，增加葡萄糖转运和利用，促进乳糖合成。同时，DZ通过上调FASN、SREBP1、PPAR-γ和ACC的表达，促进乳脂合成。
3.3 DZ对PI3K/AKT-mTOR信号通路的影响
DZ通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路，促进细胞增殖和乳成分合成。这一通路的激活可能是DZ发挥促泌乳作用的关键机制。
结论
植物雌激素DZ可通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路促进小鼠EpH4-Ev乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白及乳脂的合成，可促进葡萄糖转运入胞及利用，共同促进乳成分合成。以20 μmol·L-1 DZ浓度时，效果较好。
