最新!南京大学国家级人才携手厦门大学国家杰青JACS-合成生物学-通过工程化烯还原酶的可见光直接激发实现烯烃的对映选择性叠氮氧官能化

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一、中文标题通过工程化烯还原酶的可见光直接激发实现烯烃的对映选择性叠氮氧官能化（Enantioselective Alkene Azidooxygenation by Direct Visible-Light Excitation of an Engineered Ene-Reductase）

二、发表单位及通讯作者

• 发表单位：南京大学化学化工学院、厦门大学化学化工学院等

• 通讯作者：张艳（njuyz@nju.edu.cn）、王斌举（wangbinju2018@xmu.edu.cn）、黄小强（huangx513@nju.edu.cn）

三、科学问题如何利用可见光直接激发工程化烯还原酶，实现高对映选择性的烯烃叠氮氧官能化反应，解决该反应在不对称催化中长期未解决的挑战？

四、发表时间

时间：2026年2月

链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c18639

五、摘要      自由基型叠氮氧官能化为合成高价值的β-氧基叠氮化物提供了直接途径，但其不对称催化版本一直未能实现。本研究报道了一种净氧化型光酶促策略，通过可见光直接激发烯还原酶，实现烯烃的高对映选择性叠氮氧官能化。该系统利用光激发的黄素辅因子作为强氧化剂，与TEMPO-叠氮复合物协同作用，引发叠氮自由基的生成。随后，N₃自由基和氧中心自由基在工程化酶活性位点内协同作用，生成对映体富集的β-氧基叠氮化物，产率高达89%，对映体比例高达99.5:0.5。机理研究表明4-AcNH-TEMPO的多功能作用：促进叠氮自由基生成、立体选择性捕获前手性碳自由基、并作为终端氧化剂完成催化循环。计算模拟进一步阐明了立体控制的起源。

图1 生物催化策略

六、研究背景      有机叠氮化物是一类用途广泛的合成子，在合成化学、材料科学、药物化学以及生物正交反应中具有广泛应用。其中，β-氧基叠氮化物——其特征是在相邻β-碳上同时带有叠氮基和氧原子——作为带有邻位氮和氧原子的官能化分子前体尤为重要。烯烃的自由基型叠氮氧官能化为合成β-氧基叠氮化物提供了一种理想的策略，利用叠氮自由基的易生成特性以及2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物作为自由基捕获剂的成熟作用。2013年，Studer及其同事开发了一种通用体系，使用N₃-碘(III)试剂作为叠氮自由基源，以TEMPONa作为温和还原剂和氧源。此后，研究者发展了多种化学催化自由基叠氮氧官能化方法，包括TEMPOBF₄介导的叠氮氧官能化、锰催化的羟基叠氮化、以及铜催化的烷氧基叠氮化/氧代叠氮化。此外，可见光促进和电化学产生的自由基途径也被报道用于烯烃的羟基叠氮化/叠氮氧官能化。值得注意的是，在电化学叠氮氧官能化体系中，Lin及其同事基于TEMPO-N₃电荷转移复合物开发了一种高效的叠氮自由基生成方式。尽管取得了这些进展，该反应的不对称版本仍未实现。主要障碍在于如何控制涉及高活性叠氮自由基和TEMPO自由基中间体的双官能化反应的对映选择性。

      近年来，自由基生物催化的进展表明，酶——本质上是可持续且高效的催化剂——可以被重塑以精准和立体选择性地调控挑战性的非天然自由基转化，如金属酶、光生物催化和电酶促合成中所见。生物催化C-H叠氮化的进展 exemplifies 这一趋势。2014年，Bollinger和Krebs的开创性工作展示了非血红素铁酶可生成叠氮自由基N₃用于C-H键官能化。Chang课题组表征了一种铁(II)/α-酮戊二酸依赖性卤化酶，能够催化游离赖氨酸的挑战性自由基叠氮化。Lewis及其同事通过对铁(II)/α-酮戊二酸依赖性双加氧酶的定向进化，实现了未活化C(sp³)-H键的位点选择性叠氮化。为进一步利用叠氮自由基，Huang及其同事报道了对 Streptomyces avermitilis 来源的(4-羟基苯基)丙酮酸双加氧酶的进化，使其能够通过非生物的自由基中继C-H叠氮化实现新反应性。在非自由基酶促途径方面，Zhang及其同事鉴定了一种ATP和亚硝酸盐依赖性酶，可通过芳基肼的顺序N-亚硝化和脱水催化有机叠氮化物合成。Chen和Sun课题组分别利用工程化卤醇脱卤酶催化环氧化物开环形成手性β-羟基叠氮化物。Chen和Paul课题组则采用酶促级联反应实现烯烃的区域发散性和立体选择性羟基叠氮化。尽管已有这些 elegant 的生物催化策略用于引入叠氮基团，但烯烃的直接自由基型生物催化叠氮氧官能化仍未实现。

七、研究结果

结果1、初始活性的发现      为建立烯烃对映选择性叠氮氧官能化的生物催化平台，研究团队评估了一系列野生型烯还原酶的反应活性。以烯烃1a为底物、NaN₃为叠氮源、4-AcNH-TEMPO（2）为氧源和氧化剂，筛选发现来自 Enterobacter cloacae 的烯还原酶（PETNr）表现出最高活性和最佳立体选择性，生成产物3a的产率为28%，对映体比例为53:47。使用野生型PETNr进一步优化反应条件后，3a的产率提高至44%。

结果2、通过定向进化提高野生型PETNr的活性      研究采用半理性突变策略提升酶的性能。将产物3a对接到野生型PETNr活性位点，选择周围的12个残基进行单点突变，每个位置分别突变为丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。第一轮筛选34个变体，鉴定出6个提高对映选择性的单点突变：Y68F、S132A、Y186F、Q241L、T273L和Y351F。第二轮将这些有益位点突变为结构相似的氨基酸，筛选14个变体后获得最优单突变体Y186W（产率75%，对映体比例86:14）。随后进行两轮迭代组合，构建多突变体文库，最终获得三突变体PETNr-M3（Y68F-Y186W-Y351F），在标准条件下以75%产率和97:3的对映体比例生成产物3a。对照实验证实酶和可见光对该反应不可或缺。

图2 酶活测试及定向进化

结果3、底物范围考察      PETNr-M3对多种烯烃底物表现出良好的耐受性。常见官能团如甲基、卤素、甲氧基、叔丁基和三氟甲基均可兼容，相应产物产率最高达89%，对映体比例最高达99.5:0.5。苯环上取代基的电子效应对产率影响较小，而空间位阻影响显著：对位叔丁基取代底物产率降至13%，而对位氟代和三氟甲基取代底物反应顺利。四氢萘基和萘基底物也能良好反应。α-位取代基考察显示甲基为最优，氢和乙基取代产物立体选择性中等，异丙基取代产物对映选择性降低。反应可扩展至非活化烯烃，产率最高12%，对映体比例最高76.5:23.5。放大至0.1 mmol规模时，3a分离产率62%，对映体比例97:3。产物3a经CuAAC反应生成三唑产物4a，分离产率81%，对映体比例93:7，单晶X射线衍射确定其优势对映体为R构型。

图3 光酶催化范围

结果4、机理研究      紫外-可见吸收光谱表明黄素蛋白是标准条件下的可见光激发物种。氧化还原电位分析显示TEMPO和NaN₃均可被激发态黄素酶单电子氧化。发光猝灭实验表明，2和NaN₃对激发态黄素蛋白均有猝灭效应，其中2的猝灭效应更为显著。无2的对照实验生成氢叠氮化产物5，产率12%，表明激发态烯还原酶可氧化NaN₃生成N₃自由基引发反应。制备2的单电子氧化产物4-AcNH-TEMPO⁺ClO₄⁻，与NaN₃混合后观察到颜色变化，表明形成4-AcNH-TEMPO-N₃加合物，该复合物在室温下不稳定。质量平衡分析显示，在生成3a的同时检测到副产物6（2的还原产物），产率64%，表明2可氧化FMN半醌再生催化活性FMN氧化态物种，完成催化循环。基于此提出催化循环：蓝光激发下，酶结合FMN氧化态转化为高氧化性激发态物种，氧化2生成2⁺和FMN半醌；2⁺与N₃⁻结合形成电荷转移复合物，解离生成2和N₃自由基；N₃自由基加成至烯烃生成前手性苄基自由基中间体；该自由基被2在酶活性位点内捕获，生成对映体富集产物；额外2氧化FMN半醌再生FMN氧化态并生成副产物6。

图4 机制研究

结果5、计算研究      时间依赖密度泛函理论和密度泛函理论计算表明，从2到激发态FMNox⁺的单电子氧化放热12.3 kcal/mol，热力学有利。2⁺与N₃⁻结合形成电荷转移复合物I放热25.4 kcal/mol，该复合物均裂释放N₃自由基吸热6.6 kcal/mol，但后续N₃自由基对C=C键的自由基加成在热力学和动力学上均有利，补偿了初始能量损失。为研究立体选择性，进行经典分子动力学模拟和量子力学/分子力学计算。MD模拟显示底物1a、2和N₃自由基在PETNr-M3活性位点中稳定结合：N₃自由基与W186形成氢键，1a和2通过疏水相互作用与L271、F68、F350和F351结合。QM/MM计算表明N₃自由基与1a的加成反应能垒为4.0 kcal/mol，生成稳定前手性苄基自由基中间体。从该中间体出发，MD模拟显示其呈现两种不同构象：CH₃向上（Int. E-R）或CH₃向下（Int. E-S），分别对应生成R或S构型产物。关键二面角统计分析表明Int. E优先采用生成R构型产物的构象。QM/MM计算显示，Int. E-R与2的C₂-O偶联能垒为10.5 kcal/mol，Int. E-S为14.2 kcal/mol，R途径在动力学上更有利。结构分析显示Int. E-S中2的甲基与前手性苄基自由基的-CH₂-N₃取代基之间存在显著空间位阻，导致能垒升高。FMNH与额外2的氢原子转移能垒为8.9 kcal/mol，再生FMN氧化态并生成产物6。使用无-NHCOCH₃取代基的TEMPO进行反应时，立体选择性显著降低。MD模拟表明2的-NHCOCH₃基团与酶口袋形成稳定相互作用，有效限制前手性苄基自由基中间体的构象自由度，强烈偏好R途径（R/S = 99.8:0.2）；而TEMPO缺乏这种锚定作用，构象自由度较大（R/S = 69.8:30.2），立体选择性降低。

图5 建议的催化循环

八、讨论      本研究报道了一种基于可见光直接激发烯还原酶的净氧化型光酶促转化策略。该系统利用激发态黄素的强氧化能力，通过TEMPO-叠氮复合物增强作用，生成叠氮自由基，并在酶活性位点内协同调控N₃自由基和氧中心自由基，实现了此前难以实现的对映选择性烯烃自由基叠氮氧官能化。研究发现4-AcNH-TEMPO的多功能作用：同时促进叠氮自由基生成、立体选择性捕获前手性碳自由基、并作为终端氧化剂完成催化循环。计算研究揭示了黄素辅因子作为可见光激发氧化剂的作用，并阐明了蛋白支架如何调控自由基捕获步骤的对映选择性。这一策略拓展了烯还原酶在净氧化型非天然自由基生物转化中的应用，为未来光酶促不对称合成提供了新思路。

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