最新!南京工业大学院长&国家级重大人才工程&教育部新世纪人才团队Metab Eng-合成生物-基因组进化与代谢工程改造非常规酵母合成2-苯乙醇

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一、中文标题

整合基因组进化与系统代谢工程改造季也蒙迈耶氏酵母 用于2-苯乙醇的生物合成（Engineering the robustness of Meyerozyma guilliermondii for efficient 2-phenylethanol biosynthesis）

二、发表单位及通讯作者

发表单位：南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室
通讯作者：姜岷、信丰学、章文明

三、发表时间

时间：2026年4月1日

链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717626000509

四、科学问题

如何系统提升非常规酵母季也蒙迈耶氏酵母对高毒性芳香化合物2-苯乙醇（2-PE）的耐受性，并实现其高效生物合成？

五、摘要

     2-苯乙醇（2-PE）是一种高价值的玫瑰香型化合物，但其对微生物具有显著毒性，限制了其生物合成效率。本研究通过整合非理性诱变、适应性进化（ALE）与系统代谢工程，系统解析并重塑了Meyerozyma guilliermondii 在2-PE胁迫下的细胞耐受性网络。研究发现，多个内源耐受元件协同作用，重新分配能量与还原力，增强谷胱甘肽依赖的氧化还原缓冲能力，并强化膜与线粒体稳定性。最终工程菌株E-EA20-GA-ME在不使用原位产物回收（ISPR）条件下，2-PE产量达到7.09 g/L；结合ISPR后，产量提升至13.43 g/L。本研究为构建耐受毒性化合物的微生物平台提供了理论与工程框架。

六、研究背景

       2-苯乙醇（2-PE）是一种具有玫瑰香气的芳香醇，广泛应用于食品、化妆品、制药及日用化学品领域。传统的植物提取法成本高、产量低，而化学合成法存在环境不友好等问题。微生物合成2-PE因其发酵周期短、成本低、可持续性强而受到广泛关注。然而，2-PE对微生物具有显著的毒性作用，浓度超过2–3 g/L即可抑制大多数微生物的生长，破坏膜结构、干扰能量代谢并诱导活性氧（ROS）积累。

       为解决这一问题，研究者通常采用原位产物回收（ISPR）技术，如液-液萃取，以减轻产物抑制。然而，ISPR增加了工艺复杂性和成本，且掩盖了宿主菌株自身耐受性不足的问题。因此，开发具有高内在耐受性的微生物底盘是提升2-PE合成效率的关键。

      Meyerozyma guilliermondii 菌株YLG18天然耐受高达4 g/L的2-PE，显著优于其他酵母。此外，该菌株具有高效的Ehrlich代谢途径，能快速利用前体L-苯丙氨酸，是合成芳香族化合物的理想底盘。尽管如此，其天然耐受性仍不足以支撑高产工业化生产。

      本研究通过非理性诱变、适应性进化与系统代谢工程相结合，系统解析了2-PE毒性机制，筛选并验证了多个内源耐受元件，最终构建出具有极高2-PE耐受性和合成能力的工程菌株，显著降低了对ISPR的依赖。

七、研究结果

结果1、通过诱变与适应性进化构建高耐受菌株EA20

       研究首先通过EMS和ARTP组合诱变，筛选出能在含6 g/L 2-PE平板上生长的突变株。进一步通过180天的适应性进化，获得菌株EA20，其在5.25 g/L 2-PE条件下稳定生长。与野生型相比，EA20在3、4、5 g/L 2-PE下的比生长速率分别提高了1.53、2.81和4.26倍。此外，EA20还表现出对高温、低pH和高渗透压的交叉耐受性。在摇瓶发酵中，EA20的2-PE产量达3.15 g/L，比野生型提高40%。

图1 耐受菌株筛选

结果2、基因组与酶工程解析耐受机制

        全基因组测序发现EA20中存在12个编码区突变，涉及氨基酸代谢、氧化还原辅因子再生、能量代谢和膜运输等通路。通过等位基因替换验证，确认四个关键突变基因：Lys2（L-2-氨基己二酸还原酶）、Atr（线粒体ATP依赖性通透酶）、Gat（谷氨酰胺酰胺转移酶）和Scy（蛋白激酶结构域蛋白）。这些突变分别导致酶活性下降或构象改变。例如，Lys2突变导致NADPH依赖的酶活性下降35.21%，可能有助于细胞重新分配能量用于抗ROS应激。

图2 性能研究

图3 功能分析

结果3、组合内源耐受元件提升耐受性与产量

       将四个突变基因共同在EA20中表达，构建菌株E-EA20。虽然平板耐受性未显著提升，但在液体培养中表现出更长的生长稳定期和更高的2-PE产量。其中，E-EA20在3 g/L 2-PE下的OD600达8.52，2-PE产量为3.56 g/L，比EA20提高13%。进一步分析表明，这些突变通过减少ATP和NADPH的消耗，增强谷胱甘肽合成和膜完整性，从而提升耐受性。

图4 提高耐受

结果4、异源表达Gs和Agpat增强谷胱甘肽合成与膜稳定性

       为增强抗氧化能力，研究筛选并表达了来自Yarrowia lipolytica 的谷氨酰胺合成酶（YlGs）和来自Kluyveromyces marxianus 的谷氨酸-丙酮酸转氨酶（KmAgpat）。单独表达YlGs或KmAgpat的菌株在2.5 g/L 2-PE下生长显著优于野生型。将两者共同表达于E-EA20中，构建菌株E-EA20-GA，其在5 g/L 2-PE下的比生长速率达0.031 h⁻¹，细胞内谷胱甘肽水平提高2.4倍，2-PE产量达4.92 g/L。

图5 鉴定和评估

结果5、工程化2-PE合成途径进一步提高产量

        在E-EA20-GA中过表达内源ARO10、GAP和ARO80基因，构建菌株E-EA20-GA-ME，进一步强化2-PE合成通量。摇瓶发酵中，该菌株2-PE产量达7.09 g/L，为目前无ISPR条件下的最高报道值。

结果6、结合ISPR实现高产

        在5 L生物反应器中，E-EA20-GA-ME结合脂肪酸甲酯（FAME）ISPR系统，优化相比（1:2）和添加时间（36 h）后，2-PE产量达13.43 g/L，生产率为0.085 g/L/h，比E-EA20-GA提高30.98%。

图6 规模化发酵

八、讨论

      本研究通过整合非理性诱变、适应性进化和系统代谢工程，显著提升了M. guilliermondii 对2-PE的耐受性，创下了无ISPR条件下2-PE产量7.09 g/L的记录。四个内源突变基因（Lys2、Atr、Gat、Scy）通过重新分配能量和还原力、增强谷胱甘肽合成和膜稳定性，协同赋予细胞高耐受性。异源表达Gs和Agpat进一步强化了抗氧化能力。值得注意的是，部分突变导致酶活性下降，可能通过显性负效应或竞争性抑制机制，减少非必需代谢通路的资源消耗，从而增强抗逆性。这些耐受元件不仅适用于2-PE，还可能为其他毒性化合物的生物合成提供通用工程策略。未来可进一步优化代谢通量、拓展底物谱，并探索其在工业化发酵中的应用潜力。

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