中药复方如何护心?天津中医药大学& 南京中医药大学:藿丹清化方通过 TGR5-DHHC4 通路抑制 CD36 膜定位,以改善糖尿病心肌病的脂毒性损伤

背景：糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病相关的心脏并发症，发病率持续上升，其发病机制复杂且易反复，临床治疗面临挑战。藿丹清化方（HDQH）是一种中药复方，在临床用于治疗糖尿病心血管疾病已逾十年，能改善心功能和预后，但其具体作用机制尚不完全清楚。

糖尿病心肌病本质上是一种“心肌底物代谢失稳态”疾病 。在胰岛素抵抗背景下，心肌对脂肪酸的过度摄取（Over-uptake）远超其线粒体氧化能力，导致有害脂质堆积，引发从“能量过剩”到“结构塌陷”的病理级联反应 。

健康心肌可在葡萄糖和脂肪酸间切换；DCM 早期即出现代谢倾向偏移，心肌能耗的 90% 以上被迫依赖脂肪酸氧化。心肌细胞膜上的转运蛋白（如 CD36）在高血糖/高脂环境下发生异常转位，持续开启脂肪酸进入细胞的通道 。未被氧化的脂肪酸转化为神经酰胺（Ceramide）和二酰基甘油（DAG）等毒性脂质 。

TGR5-DHHC4-CD36轴是心肌代谢从“脂毒性过载”向“代谢稳态”回归的关键闸门。通过激活 TGR5 诱导的信号级联，调控棕榈酰转移酶 DHHC4，从空间定位上阻断 CD36 向细胞膜的迁移，从而从源头上切断了诱发心肌损伤的有害脂肪酸流。

目的：探讨HDQH是否通过减少脂肪酸摄取（FAU）来减轻心脏脂毒性，从而阐明其治疗DCM的潜在机制。

方法：

1. 成分鉴定：采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术鉴定HDQH及其体内生物活性成分。

2. 靶点预测：利用网络药理学和分子对接技术预测HDQH治疗DCM的关键靶点和信号通路。

3. 体内实验：通过高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）诱导建立C57BL/6J小鼠糖尿病模型，灌胃给予HDQH 12周。通过超声心动图、Masson三色染色和HE染色评估心脏功能和形态；通过油红O染色和荧光标记脂肪酸检测心肌脂质沉积和FAU；通过ELISA和生化检测测定总胆汁酸、胰岛素、NT-proBNP和血脂水平；检测游离脂肪酸（FFAs）和活性氧（ROS）水平；通过Western blot和实时定量PCR（RT-qPCR）探索潜在分子机制。

4. 体外实验：采用棕榈酸（PA）诱导H9C2心肌细胞损伤模型，通过药理学激活和抑制靶蛋白表达进一步验证HDQH的作用机制。

结果：

1. 成分分析：在血浆中鉴定出16种化合物及代谢物，主要成分包括巴马汀（palmatine）、补骨脂色烯醇（bavachromanol）、马钱苷元（loganetin）、氧化小檗碱（oxyberberine）和新隐丹参酮（neocryptotanshinone）。

2. 靶点预测：网络药理学和分子对接分析提示HDQH可能通过调节TGR5受体相关信号通路发挥治疗DCM的潜在作用。

3. 体内药效：HDQH显著改善DCM小鼠心脏功能，有效减轻心肌肥厚、纤维化和脂质沉积；同时升高总胆汁酸水平，降低FFA和ROS水平。

4. 分子机制：Western blot和RT-qPCR分析表明，HDQH抑制心脏脂毒性与调节心肌细胞膜上TGR5、DHHC4和CD36的表达密切相关。

5. 体外验证：HDQH激活TGR5表达，导致下游靶点DHHC4受到抑制，进而通过抑制CD36膜定位减少过度的FAU。值得注意的是，TGR5抑制剂SBI-115可减弱HDQH的有益作用。

结论：HDQH通过调控TGR5-DHHC4通路，抑制CD36膜定位，从而减少心脏脂肪酸摄取和脂质积聚，发挥对DCM的心肌保护作用。该研究为HDQH治疗糖尿病心肌病提供了有力的机制证据。

图1 HDQH生物活性化合物的特征。

(A) HDQH含药血清在正离子模式下检测的基峰离子（BPI）色谱图。(B) HDQH含药血清在负离子模式下检测的BPI色谱图。(C) HDQH在正离子模式下检测的BPI色谱图。(D) HDQH在负离子模式下检测的BPI色谱图。(E) HDQH中排名前5位成分的化学结构式。

图2 HDQH活性成分靶点预测及TGR5结合验证。

(A) 药物-成分-靶点网络图。(B) GO生物学过程富集分析。(C) GO富集分析（包括生物过程BP、细胞组分CC、分子功能MF）。(D) HDQH活性成分与TGR5的分子对接图。BE：结合能。

图3  HDQH有效改善DCM小鼠异常的糖脂及胆汁酸代谢。

(A) DCM小鼠模型建立流程图。(B-E) 小鼠12周内体重、摄食量、饮水量及空腹血糖水平的变化。(F-H) 总胆汁酸、胰岛素及稳态模型评估胰岛素抵抗指数。(I-L) 甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平。

图4  HDQH改善DCM小鼠心脏功能与结构重塑。

(A-G) 峰值E/e'比值、缩短分数、左心室射血分数、舒张期室间隔厚度、收缩期室间隔厚度、舒张期左心室内径、收缩期左心室内径。(H) 超声心动图典型图像。(I) N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）水平。(J) 小鼠胫骨照片。(K-L) 心脏重量/胫骨长度（HW/TL）比值和心脏重量/体重（HW/BW）比值。(M) Masson染色测定的纤维化面积。(N-O) Masson染色和HE染色代表性图像。

图5  HDQH抑制DCM小鼠心肌脂肪酸摄取（FAU）和脂质蓄积。

(A) 血清中游离脂肪酸（FFA）水平。(B) 心肌组织中FFA水平。(C) 心脏组织中脂肪酸的相对荧光单位（FAU）。(D-E) 油红O染色代表性图像及染色面积百分比。(F) Western blot检测心脏组织中CPT1B蛋白表达水平。(G) 心脏组织中CPT1B相对蛋白表达水平。(H) 心脏组织中ROS水平。

图6 HDQH调控TGR5-DHHC4通路并抑制CD36膜定位。

(A-C) 心脏组织中CD36的总蛋白、mRNA和膜蛋白相对表达水平。(D) Western blot检测心脏组织中TGR5、DHHC4和CD36的蛋白表达水平。(E) Western blot检测心脏组织中CD36膜蛋白表达水平。(F-G) 心脏组织中TGR5的相对蛋白和mRNA表达水平。(H-I) 心脏组织中DHHC4的相对蛋白和mRNA表达水平。

图7 HDQH抑制棕榈酸（PA）诱导的心肌细胞脂肪酸摄取（FAU）。

(A-B) CCK-8法检测不同浓度PA及含药血清对细胞活力的影响。(C) 基于多功能酶标仪检测的心肌细胞FAU相对荧光单位。(D) 荧光显微镜下观察的心肌细胞FAU相对平均荧光强度。(E) 心肌细胞活性氧（ROS）的平均荧光强度。(F-G) 心肌细胞FAU和ROS的典型荧光图像。

图8  HDQH通过调控TGR5-DHHC4通路抑制CD36膜定位。

(A) Western blot检测心肌细胞中TGR5、DHHC4和CD36的蛋白表达水平。(B-G) 心肌细胞中CD36、TGR5和DHHC4的相对蛋白和mRNA表达水平。(H-I) Western blot检测心肌细胞中CD36膜蛋白及其相对蛋白表达水平。(J) CD36和ATP1A1双重荧光染色的相对荧光强度及代表性图像，显示CD36在膜上的表达。(K) CD36和ATP1A1双重荧光染色的代表性图像。