南京大学医学院附属鼓楼医院 | 靶向 p300 或成多囊卵巢综合征治疗新策略

本研究采用体内外结合的多维度研究策略，动物层面构建 DHEA 诱导与高脂饮食诱导两种 PCOS 小鼠模型，构建颗粒细胞特异性 p300 敲除（Ep300GC-/-）小鼠，使用 p300 抑制剂 C646/A-485、SP1 抑制剂光神霉素、AR 激动剂 DHT 进行干预；细胞层面分离小鼠原代颗粒细胞、使用 KGN 与 HEK293T 细胞系，构建 PCOS 细胞模型并开展药物处理；检测技术包括 HE 与 Masson 染色评估卵巢病理与纤维化，免疫组化 / 免疫荧光定位蛋白表达，Western blot、RT-PCR 检测分子水平，RNA-seq 与 ATAC-seq 分析转录组与染色质开放状态，ChIP、Co-IP 验证蛋白 - DNA、蛋白 - 蛋白相互作用，双荧光素酶报告基因检测 AR 启动子活性，同时分析临床 GEO 数据库验证人源样本相关性，所有数据经统计学检验确保可靠性。

PCOS 小鼠卵巢与临床患者颗粒细胞中 p300、AR 表达显著上调，伴随 H3K18ac/H3K27ac 升高与卵巢纤维化；p300 是 PCOS 中特异性升高的 HAT，其通过乙酰化 AR 启动子 H3K18/H3K27 使染色质开放，结合 SP1、BRD4 形成转录复合物驱动 AR 转录；颗粒细胞特异性敲除 p300 或用 C646/A-485 抑制 p300，可降低 AR 活化、减轻卵巢纤维化、恢复动情周期；ATAC-seq 显示 AR 启动子染色质开放度增加，SP1 为核心结合转录因子，抑制 SP1 可阻断 AR 激活；p300、SP1、BRD4 在人 / 鼠样本中均与 AR 呈强正相关；AR 激动剂 DHT 可抵消 p300 抑制剂的卵巢保护作用，证实 p300 通过 AR 通路介导 PCOS 病理进展。

Figure 1 通过 DHEA 诱导的 PCOS 小鼠模型与对照组对比，从组织形态、分子表达、临床数据验证等多个层面证实，PCOS 小鼠卵巢存在黄体数量减少、窦前卵泡增多、胶原沉积引发的卵巢纤维化等病理改变，同时卵巢组织中组蛋白乙酰转移酶 p300、雄激素受体 AR、纤维化标志物 α-SMA 和 I 型胶原的蛋白水平显著升高；结合人 PCOS 患者卵巢颗粒细胞的 RNA-seq 公共数据，也发现 EP300 与 AR 基因表达显著上调，免疫组化显示 p300 和 AR 在颗粒细胞中高表达，卵巢整体组蛋白乙酰化水平上升，Ar 的 mRNA 转录水平也明显增加，全面揭示 PCOS 卵巢存在 AR 异常激活、p300 高表达与组蛋白乙酰化增强的核心表型。

Figure 2 聚焦 p300 对 AR 转录的调控机制，首先筛选出 PCOS 小鼠卵巢中仅 p300 在 HAT 家族成员中特异性高表达，且组蛋白 H3K18、H3K27 位点乙酰化（H3K18ac、H3K27ac）显著升高，同时 BRD4 与 p300、AR 在颗粒细胞内共定位；体外细胞实验证实 p300 激动剂 CTPB 可上调 AR 表达，而 p300 特异性抑制剂 C646、A-485 能剂量依赖性降低 H3K18ac、H3K27ac 水平并逆转 DHEA 诱导的 AR 高表达，荧光素酶报告基因实验也验证 C646 可抑制 AR 启动子活性，明确 p300 通过催化 H3K18 和 H3K27 乙酰化正向调控颗粒细胞中 AR 的转录激活。

Figure 3 通过构建颗粒细胞特异性 Ep300 敲除小鼠（Ep300^{GC-/-}），在体内水平验证 p300 的功能作用，结果显示相较于野生型 PCOS 小鼠，Ep300^{GC-/-} PCOS 小鼠卵巢黄体数量显著增多、胶原沉积与纤维化程度明显减轻，免疫组化显示颗粒细胞中 AR 阳性表达面积减少，蛋白检测也证实 p300 敲除后 AR、α-SMA、I 型胶原的表达均显著降低，直接证明颗粒细胞中 p300 是驱动 PCOS 小鼠卵巢 AR 激活与纤维化的关键因子。

Figure 4 采用 DHEA 诱导和高脂饮食两种 PCOS 小鼠模型，评估 p300 药理学抑制剂 C646 的治疗效果，发现 C646 干预可显著恢复 PCOS 小鼠的动情周期规律，改善体重与卵巢重量异常，同时增加卵巢黄体数量、减少原始 / 初级卵泡比例并缓解胶原纤维化，分子层面则能下调 p300、AR、纤维化标志物及 H3K18ac、H3K27ac 的表达，从整体表型到分子机制证实抑制 p300 可有效缓解 PCOS 小鼠卵巢 AR 异常激活与纤维化病变。

Figure 5 借助 RNA-seq 与 ATAC-seq 测序技术，解析 PCOS 卵巢 AR 转录激活的染色质调控机制，结果显示 PCOS 小鼠卵巢染色质整体开放性升高，且 AR 基因位点染色质开放程度与转录水平同步上调，AR 启动子区域富集最高的转录因子为 SP1，SP1 在 PCOS 卵巢中表达升高且结合于 AR 启动子，同时 p300、BRD4 也与 AR 启动子结合，SP1 抑制剂普利霉素可降低 DHEA 诱导的 AR 表达，揭示 SP1 是介导 p300 调控 AR 转录的关键转录因子。

Figure 6 深入验证 p300、SP1、BRD4 形成转录复合物调控 AR 的机制，首先在人和小鼠组织中证实 p300、SP1 与 AR 表达呈显著正相关，ChIP 实验显示 p300、SP1 结合于 AR 启动子的 SP1 结合基序，且该结合依赖 H3K18ac、H3K27ac 修饰，可被 C646 或普利霉素抑制；Co-IP 与免疫荧光共定位证实 PCOS 状态下 p300、SP1、BRD4 在细胞核内形成复合物，荧光素酶实验进一步证明 SP1 通过结合 AR 启动子特异性激活其转录，明确三者形成转录轴驱动 AR 异常表达。

Figure 7 通过回补 AR 激动剂 DHT，验证 p300 抑制剂改善 PCOS 病变的作用依赖于 AR 信号抑制，结果显示 C646 能显著改善高脂饮食 PCOS 小鼠的卵巢黄体减少、纤维化加重等病理表型，并下调 p300、AR 及纤维化标志物表达，而额外给予 DHT 持续激活 AR 后，C646 的抗纤维化与卵巢保护作用几乎完全消失，最终明确 p300 通过激活 AR 信号通路介导 PCOS 卵巢纤维化，抑制 p300 主要通过阻断 AR 通路发挥治疗效果，并总结出 p300-SP1-BRD4-AR 轴的完整致病机制。