拿单细胞测序数据扫了一圈，发现SEMA3G在胶质母细胞瘤的血管内皮细胞里表达掉得特别狠，而且这个掉表达跟病人预后差有直接关系。他们还拿了病人的肿瘤组织和脑脊液来实测，发现不管是mRNA还是蛋白水平，SEMA3G都比正常脑组织少了一大截。
总之，SEMA3G在GBM里是低表达的，而且主要在血管内皮细胞里表达，这暗示它可能是个保护因子（图1）。
复现建议：去GEO或TCGA下载GBM的单细胞和bulk RNA-seq数据，用Seurat分析不同细胞类型的SEMA3G表达。再用自己收集的GBM和正常脑组织样本，做qPCR和Western Blot验证表达差异，顺便用ELISA测一下脑脊液里的SEMA3G浓度。
先用CellChat预测发现，SEMA3G的主要作用对象是肿瘤细胞。然后在小鼠脑子里特异性地敲掉内皮细胞的Sema3G基因，结果肿瘤长得飞快、老鼠死得也早。反过来，给老鼠脑子过表达SEMA3G或者直接打重组蛋白，肿瘤就明显变小了，老鼠活得更久。这就说明内皮来源的SEMA3G确实能压制GBM进展（图2）。
复现建议：用Cdh5-Cre工具鼠和Sema3G-floxed小鼠做内皮特异性敲除，原位注射GL261-Luc细胞后定期活体成像。过表达组用AAV-SEMA3G立体定位注射，两周后再种肿瘤。治疗组可以在种瘤后3天开始瘤内注射重组蛋白，每3天一次。
把重组SEMA3G蛋白加到GSC细胞里，发现细胞活力和成球能力都明显下降，极限稀释实验也显示干细胞比例降低了。他们还做了过表达SEMA3G的HUVEC，把这种细胞的上清加到GSC里，同样能抑制干性。但如果先用NRP2中和抗体处理，这种抑制效果就消失了，说明SEMA3G确实是靠NRP2起作用的（图3）。
复现建议：用慢病毒构建SEMA3G过表达的HUVEC，收上清做条件培养基。GSC细胞用Neurobasal+B27+EGF+bFGF培养。用CCK-8测增殖，极限稀释法算干细胞频率，成球实验拍照计数。NRP2中和抗体加进去做阻断，看效果是否被逆转。
他们发现SEMA3G处理GSC后，c-Myc蛋白水平明显下降，但mRNA没变，说明是翻译后调控。放线菌酮实验显示c-Myc的半衰期明显变短了。再用MG132抑制蛋白酶体，c-Myc的下降就被完全逆转了。而且SEMA3G处理后c-Myc的泛素化水平显著升高。结论就是SEMA3G通过泛素-蛋白酶体途径让c-Myc降解（图4）。
图4 SEMA3G在GSCs中降低c-Myc蛋白的稳定性
复现建议：用重组SEMA3G处理GSC细胞48-72小时，收蛋白和RNA做Western Blot和qPCR检测c-Myc。CHX实验加CHX不同时间点收样。泛素化实验用MG132预处理6小时，再用co-IP富集c-Myc，泛素抗体检测。
先筛了一圈可能的E3连接酶，发现只有WWP2能和c-Myc结合。过表达WWP2会让c-Myc蛋白变少、泛素化增加、半衰期变短；沉默WWP2则相反。关键的是，如果先把WWP2敲低，SEMA3G对c-Myc的降解作用就完全没了，对GSC成球的抑制也减弱了。这就说明SEMA3G是靠着WWP2来降解c-Myc的（图5）。
图5 SEMA3G通过依赖WWP2的方式促进c-Myc降解
复现建议：用慢病毒shRNA做WWP2稳定敲低，或用过表达质粒做瞬时过表达。检测c-Myc用Western Blot，泛素化用co-IP。CHX实验测半衰期。成球实验看敲低WWP2后SEMA3G还能不能抑制成球。结合String数据库预测相互作用。
用TurboID邻近标记技术发现，SEMA3G的受体复合物是NRP2和PLXNA1。沉默PLXNA1之后，SEMA3G对c-Myc的降解作用就消失了。进一步分析发现，SEMA3G处理会显著降低Cdc42的活性，但不影响RhoA和Rac1。说明SEMA3G是通过NRP2/PLXNA1这条通路让Cdc42失活的（图6）。
图6 SEMA3G通过GSCs中的NRP2/PLXNA1失活Cdc42
复现建议：用shRNA敲低PLXNA1，再给SEMA3G处理，检测c-Myc变化。Cdc42活性用GST-CRIB pull-down检测。TurboID实验把NRP2和miniTurbo融合表达，加biotin标记，再用链霉亲和素磁珠富集，质谱鉴定互作蛋白。
