英文标题：Pentose phosphate pathway fuels cGAS-STING signalling to boost function of intratumoral conventional dendritic cells
发表期刊：nature communications
影响因子：15.7
客户单位：南京医科大学
百趣提供服务：AQ能量代谢高通量靶标定量
肿瘤可通过多种机制抑制肿瘤微环境内常规树突状细胞(cDCs)的功能，但其背后分子机制目前尚不明确。本研究明确戊糖磷酸途径(PPP)是STING介导的cDCs抗肿瘤免疫中的内在代谢检查点，并表明靶向cDCs中的PPP活性是一种具有前景的癌症免疫治疗策略。
01.晚期肿瘤来源的肿瘤浸润cDCs呈现功能异常特征
为探究肿瘤进展过程中肿瘤浸润树突状细胞的动态变化，本研究分别从MC38结直肠癌荷瘤小鼠的早期与晚期分离树突状细胞，开展单细胞RNA测序分析（图1a）。对单细胞测序数据中的DC亚群进行鉴定。首先剔除高表达谱系标志物的细胞类群；再将肿瘤浸润树突状细胞划分为四大主要亚群（图1b）。晚期肿瘤中pDCs与cDCs占比下降，mo‑DCs逐渐成为优势细胞类群（图1c）。流式细胞术检测证实，晚期瘤内cDCs表面成熟标志物表达水平显著降低（图1d-e）。树突状细胞关键功能基因也被明显抑制（图1f）。CCR7、Cxcl9和Cxcl10在晚期肿瘤内cDCs中均下调(图1g)。基因集富集分析显示，晚期瘤内cDCs的抗原加工与呈递能力显著受损，适应性免疫应答与T细胞介导免疫均受到负向调控（图1h）。与早期cDCs相比，晚期刺激OT‑I T细胞增殖的能力显著下降（图1i-j），且诱导效应细胞因子分泌的能力明显减弱（图1k）。
为系统评估各cDCs亚群的功能差异，本研究等量分离早、晚期肿瘤浸润的成熟DC、cDC1与cDC2：将成熟DC与cDC1s分别和OT‑I T细胞共培养，cDC2与OT‑II T细胞共培养，并加入SIINFEKL抗原肽。相较于早期细胞，晚期成熟DC刺激OT‑I T细胞增殖（图1l-m）与分泌效应细胞因子（图1n）的能力显著减弱；同时，晚期cDC1与cDC2的T细胞启动活化能力也普遍下降（图1o–t）。
图1.晚期肿瘤中的肿瘤浸润性cDCs呈现功能耗竭特征
随着肿瘤进展，瘤内cDCs的多项关键生物学过程发生显著改变，鉴于代谢重编程在调控瘤内树突状细胞功能与抗肿瘤免疫中的关键作用，本研究进一步聚焦中心碳代谢开展分析（图2a）。晚期瘤内cDCs中PPP相关代谢物水平显著降低，而糖酵解代谢物未呈现统一变化规律（图2b）。晚期瘤内cDCs的核苷酸含量显著减少（图2c）。
为在体内验证上述结论，本研究采用抑制剂G6PDi-1与6-氨基烟酰胺(6-AN)处理早期瘤内cDCs。结果显示，抑制PPP可显著下调树突状细胞成熟标志物（图2d-e），并降低Tnfa、Il12、Ccr7等功能基因的表达（图2f）。随后，将经PPP抑制剂处理的早期瘤内cDCs过继回输至荷瘤小鼠体内，与未处理组相比，G6PDi-1或6-AN处理后的cDCs抑制肿瘤生长的能力显著减弱（图2g）；同时，肿瘤微环境中分泌IFN-γ与TNF-α的CD4⁺、CD8⁺T细胞比例明显下降（图2h-i），利用激动剂AG1上调晚期瘤内cDCs的PPP活性后，体外实验可见细胞成熟标志物与功能基因表达均显著上调（图2j–m），且细胞体内抗肿瘤功能得以有效恢复（图2n–p）。
PPP的起始反应由G6PD催化，可将6-磷酸葡萄糖(G6P)转化为6-磷酸葡萄糖酸内酯(6PGL)（图3a），且G6pd是该通路唯一的限速酶。相较于野生型DC，PPP缺陷型DC诱导OT-I T细胞增殖的能力减弱（图3b-c），且诱导效应细胞因子分泌的水平显著降低（图3d）。cDCs中PPP缺陷可显著加速肿瘤生长（图3e），并缩短小鼠生存期（图3f）。PPP活性缺失会导致肿瘤浸润cDCs中关键功能基因表达下调（图3g）。同时，cDCs的PPP缺失与肿瘤微环境内分泌IFN‑γ、TNF‑α的CD4⁺及CD8⁺T细胞比例降低密切相关（图3h-i）。树突状细胞PPP缺陷会普遍削弱机体抗肿瘤免疫能力（图3j–n）。
04.cDCs中PPP缺失可抑制STING信号通路
为深入探究PPP调控cDCs功能的核心分子机制，本研究分别从MC38荷瘤野生型(WT)与cDC特异性PPP敲除(KO)小鼠中分离瘤内cDCs，开展单细胞高精度转录组测序。PCA结果显示，WT与KO小鼠的瘤内cDCs存在显著的转录组差异（图4a）。KEGG通路富集分析进一步发现，胞质DNA感知通路、JAK‑STAT信号通路及PI3K‑AKT信号通路发生明显富集（图4b）。WB结果显示，晚期瘤内cDCs的STING与STAT1磷酸化水平显著降低，提示cGAS‑STING及JAK‑STAT通路活化受阻；反观PI3K‑AKT通路，早、晚期cDCs的AKT磷酸化水平无明显差异，说明该通路活性未发生改变（图4c）。G6pdx缺失可显著抑制STING与STAT1的磷酸化，但对AKT磷酸化无明显影响（图4d）。同时，KO小鼠DC的I型干扰素表达水平显著下调（图4e）。
05.PPP维持STING介导的cDCs抗肿瘤免疫
相较于WT DC，STING缺失DC会明显加速肿瘤生长。进一步对比G6pdx/STING双敲DC与STING单敲除DC发现：二者在肿瘤生长速率、效应T细胞占比方面均无显著差异，提示PPP缺失不会在STING缺陷背景下进一步加重免疫抑制表型（图4f-g）。AG1干预可显著增强野生型DC的抗肿瘤作用、延缓肿瘤进展；而在STING缺失的DC中，AG1无法有效抑制肿瘤生长，亦不能重塑抗肿瘤免疫应答（图4h-i）。
本研究采用6-AN单独或联合小鼠STING特异性小分子激动剂DMXAA处理骨髓来源树突状细胞(BMDCs)。在 BMDC肿瘤治疗模型中，与未处理组相比，6-AN单独刺激的DC会促进肿瘤生长，并降低肿瘤微环境中分泌IFN‑γ与TNF‑α的CD4⁺、CD8⁺T细胞比例。反之，6-AN联合DMXAA处理的DC可显著延缓肿瘤进展、恢复T细胞的效应细胞因子分泌功能，整体抗肿瘤能力与未处理DC无明显差异（图4j-k）。PPP缺失会显著抑制STING信号传导及I型干扰素表达；而在KO‑DC中加入DMXAA刺激后，细胞体外STING通路活性与I型干扰素分泌可有效恢复，并在体内重塑DC介导的抗肿瘤免疫功能（图4l-m）。相较于未处理的晚期瘤内cDCs，DMXAA干预组可显著延缓肿瘤生长、增强T细胞的细胞因子分泌功能，使其免疫功能恢复至与早期瘤内cDCs相当的水平（图4n-o）。
图4.cDCs中PPP缺失会抑制STING信号通路活化
06.PPP缺陷减少2’3’-cGAMP生成，进而抑制STING信号通路
相较于早期肿瘤浸润cDCs，晚期cDCs的2',3'-cGAMP含量显著降低（图5a）。同时，cDCs中PPP通路缺陷会明显抑制2',3'-cGAMP的合成（图5b、5d）。cDCs中PPP功能缺失会显著下调胞内ATP与GTP水平，该浓度的核苷酸补充可将KO细胞内ATP、GTP含量回调至野生型水平（图5c、5e），并逆转KO细胞中2',3'-cGAMP的合成不足（图5f）。ATP与GTP水平的恢复可有效挽救KO树突状细胞中STING磷酸化（图5g）及I型干扰素的表达（图5h）。与嘧啶代谢抑制不同，嘌呤代谢受阻会显著抑制STING激活后2',3'-cGAMP的生成（图5i）；且嘌呤代谢缺陷会同步导致树突状细胞内ATP与GTP水平降低（图5j）。在6-巯基嘌呤(6-MP)处理条件下，外源补充ATP与GTP可成功恢复2',3'-cGAMP的合成及STING信号通路活性（图5j–n）。鉴于2',3'-cGAMP合成不足是PPP缺陷抑制STING信号的核心环节，本研究直接向KO树突状细胞补充2',3'-cGAMP，使其水平恢复至野生型水平（图5o）。结果显示，2',3'-cGAMP的回补可有效恢复STING信号通路的活化（图5p、5q）。
图5.PPP敲除可显著削弱cDCs的STING信号
相较于未处理的KO树突状细胞组，核苷酸补充组的肿瘤体积显著缩小（图6a）；瘤内浸润的CD11c⁺固有免疫细胞、CD4⁺ T细胞与CD8⁺ T细胞数量明显回升（图6b），分泌IFN‑γ与TNF‑α的效应CD4⁺、CD8⁺ T细胞比例也显著增加（图6c-d）。AG1激活PPP通路，可明显提升树突状细胞介导的抗肿瘤免疫治疗效果（图6e）。但在KO树突状细胞中，AG1处理无法有效抑制肿瘤生长（图6e），亦不能改变瘤内CD11c⁺细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞的浸润水平（图6f），以及效应T细胞的细胞因子分泌能力（图6g-h）。
单独使用抗PD‑L1抗体可有效缩小肿瘤体积，AG1联合抗PD‑L1抗体可进一步显著减轻肿瘤负荷（图6i）；肿瘤微环境中CD11c⁺固有免疫细胞、CD4⁺ T细胞及CD8⁺ T细胞浸润水平明显升高（图6j），分泌IFN‑γ与TNF‑α的CD4⁺、CD8⁺效应T细胞比例也显著上调（图6k-l）。
图6.PPP可增强树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗疗效
08.PPP维持乳腺癌患者树突状细胞的STING信号通路
基于TCGA数据库进一步分析cDC特征基因与PPP通路特征基因的相关性，结果显示二者在乳腺癌样本中显著正相关（图7a）。从乳腺癌临床组织中新鲜分离原代树突状细胞，与小鼠实验结果一致，利用G6PDi-1与6-AN抑制PPP通路后，人乳腺癌树突状细胞的STING磷酸化水平（图7b）及I型干扰素表达（图7c）均显著下调。抑制嘌呤代谢可显著阻断STING信号传导，而嘧啶代谢抑制对STING通路无明显影响（图7d–f）。机制层面，抑制PPP或嘌呤代谢均会降低胞内ATP与GTP含量（图7g、7l），减少第二信使2',3'-cGAMP的合成（图7h、7m），进而下调STING磷酸化水平、抑制I型干扰素分泌，外源补充ATP与GTP可恢复PPP或嘌呤代谢受阻所致的核苷酸耗竭，有效重塑STING信号通路活性（图7i-k、n、o）。此外，在PPP及嘌呤代谢受抑的细胞中，直接回补2',3'-cGAMP同样能够挽救STING信号功能（图7p–s）。
图7.PPP可维持乳腺癌患者临床样本中树突状细胞的STING信号特征
本研究证实PPP的活性是维持肿瘤浸润树突状细胞功能的关键，并阐明了PPP与cGAS‑STING信号通路之间的内在调控机制。将PPP确立为肿瘤浸润树突状细胞的核心代谢检查点，提示靶向调控该通路有望成为肿瘤免疫治疗的全新高效策略。
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