肾缺血再灌注（I/R）损伤是急性肾损伤（AKI）的主要诱因，其核心病理机制为氧化应激爆发与免疫细胞浸润形成的自我放大正反馈环路，可引发肾小管损伤、炎症级联反应，最终导致肾功能急剧下降甚至慢性化进展。当前临床缺乏针对性干预手段，而兼具良好生物相容性与类酶抗氧化活性的碳点（CDs）纳米材料成为潜在治疗方向，现有研究多以单一中药为碳点前驱体，未能充分发挥中药配伍的协同增效优势。

鉴于此，南京大学赵晓智教授团队等人以经典中药药对黄芪（AM）与当归（AS）为复合前驱体，采用一步水热法合成富氮碳点纳米酶（AM-AS@CDs）（图1）。AM-AS@CDs展现出优于单味中药源碳点的超氧化物歧化酶（SOD）模拟活性。体内实验证实，AM-AS@CDs能显著减轻I/R诱导的急性肾损伤，并减少肾组织中的免疫细胞浸润。相关研究成果以“Engineered Carbon Dots from a Traditional Herb Pair Orchestrate Concurrent Antioxidant and AP-1-Mediated Inflammation to Attenuate Renal Ischemia-Reperfusion Injury”为题，于近期发表于《Advanced Science》上。

图1 AM-AS@CDs的合成及其缓解肾缺血再灌注损伤机制的示意图

【CDs的设计、合成与结构表征】

研究采用水热法分别制备了黄芪衍生碳点（AM@CDs）、当归衍生碳点（AS@CDs）及黄芪-当归复合碳点（AM-AS@CDs）。结构表征显示，三种碳点在280 nm附近出现特征吸收峰；荧光激发光谱（发射波长450 nm）在360 nm附近呈现宽峰，表明该波长为最佳激发波长，在此激发下三种碳点溶液均发射蓝色荧光（图2a-c）。动态光散射测得AM@CDs、AS@CDs和AM-AS@CDs的水合粒径分别约为4.4、3.4和4.1 nm，小尺寸有利于其跨越生物屏障（图2d-f）。高分辨透射电镜显示晶格条纹间距为0.21 nm，对应石墨碳的（100）晶面（图2g）。X射线衍射在约22°处出现宽峰，归属于无序石墨碳的（002）晶面，而43°处无明显尖锐峰，符合超小碳点有限堆叠有序度的特征（图2h）。拉曼光谱显示三种碳点在约1350 cm^-1和1580 cm^-1处均有特征峰（图2i）。此外，三种碳点的Zeta电位均为负值（-20至-25 mV），证实了其在水溶液中具有适度的胶体稳定性（图2j）。

图2 CDs的设计、合成及结构表征

【CDs表面性质解析】

研究采用傅里叶变换红外光谱与X射线光电子能谱系统表征三种碳点的表面化学特性。红外光谱显示，所有碳点均含有─OH/─NH、C─H、C═O及芳香骨架等相似官能团（图3a-c）。X射线光电子能谱元素分析揭示关键差异（图3d-f）：复合碳点AM-AS@CDs的氮含量（7.55%）显著高于单一组分AM@CDs（1.52%）和AS@CDs（2.82%），且首次出现石墨氮构型。C 1s精细谱证实其C─C/C─N和C═O键比例分别增加约1.8倍和1.5倍（图3g-i）。上述结果表明，AM-AS复合前驱体通过协同热转化效应，有效促进了氮掺杂深度、缺陷密度及表面官能团的富集，为精准调控碳点表面化学提供了新策略。

图3 AM@CDs、AS@CDs 与 AM-AS@CDs的表面化学表征

【CDs类酶抗氧化活性的解析】

为系统研究AM@CDs、AS@CDs与 AM-AS@CDs的类抗氧化酶特性，在生理pH条件下开展了多维度活性评估。首先检测了它们对多种ROS的催化能力。复合碳点AM-AS@CDs的SOD活性显著高于单一组分碳点（图4a），但未检测到CAT、POD及OXD活性，电子顺磁共振证实无羟基自由基生成，排除了氧化副作用风险（图4b）。还采用ABTS⁺・与DPPH・法评估了碳点对活性氮（RNS）的清除能力亦显著优于单一组分碳点（图4c、d）。综上，AM‑AS@CDs 在多项抗氧化指标上均表现出更优的清除效率，体现出出色的综合抗氧化性能，凸显AM-AS@CDs在防治缺血再灌注诱导急性肾损伤方面的巨大应用潜力（图 4e、f）。前驱体比例筛选确定1:1为最优配方。表面官能团掩蔽实验揭示（图4j-l）：氨基对SOD活性起关键作用，羧基和羟基协同参与催化调控。机制上，AM-AS@CDs的高氮掺杂量（7.55%）、高缺陷密度及独特的石墨氮构型共同降低了超氧阴离子清除能垒，促进了电子转移，从而赋予其优异的抗氧化性能。

图4 CDs类酶抗氧化活性综合评价及催化机制研究

【AM-AS@CDs减轻细胞氧化应激与凋亡】

基于AM-AS@CDs卓越的SOD模拟活性及复合草药体系来源，系统评估了其抗氧化潜能与对H₂O₂诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用。细胞毒性实验确定30μg/mL为最优工作浓度。随后采用H₂O₂构建氧化损伤模型，以模拟缺血再灌注后出现的活性氧爆发。DCFH-DA荧光探针及流式细胞术显示，AM-AS@CDs显著降低胞内ROS水平，效果优于单一组分碳点及临床抗氧化剂NAC（图5a-c）。Annexin V-FITC/PI双染证实其抗凋亡能力亦最强（图5d、e）。该保护效应在永生化细胞与原代细胞中均得到验证，表明其作用具有细胞类型普适性。综上，AM-AS@CDs对氧化应激诱导的肾小管上皮细胞损伤具有优越的抗氧化与抗凋亡保护效果。

图5 AM-AS@CDs的体外抗氧化与抗凋亡活性

【AM-AS@CDs在体内减轻肾缺血再灌注损伤】

基于上述发现，本研究在小鼠双侧肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中，系统对比了AM@CDs、AS@CDs 与AM-AS@CDs的治疗效果。采用预防-治疗联合给药方案（图6a）。结果显示，AM-AS@CDs显著降低血清肌酐（CRE）与血尿素氮（BUN）及肾损伤标志物Kim-1、Lcn2水平，减轻肾小管病理损伤，而单一组分碳点无显著疗效（图6b-g）。再灌注后给药仍具保护作用，但效果弱于预防-治疗方案。生物安全性评价证实AM-AS@CDs无脏器毒性及肝肾功能异常（图6i）。体内分布成像显示其注射后2小时即靶向富集于肾脏（图6h），且I/R损伤肾脏的摄取量显著高于正常肾脏（图6j）。综上，AM-AS@CDs通过肾脏靶向蓄积、抑制肾小管损伤及恢复肾功能，有效减轻I/R-AKI，且具有良好的生物安全性。

图6 AM-AS@CDs对缺血再灌注肾损伤的保护作用及体内分布

【AM-AS@CDs抑制肾缺血再灌注损伤后外周血及肾脏组织中免疫细胞募集与浸润】

缺血损伤后免疫细胞募集是肾缺血再灌注损伤后续肾脏炎症反应的关键始动因素。中性粒细胞等固有免疫细胞可释放促炎细胞因子与趋化因子，进一步招募循环白细胞浸润至受损肾脏，进而加剧组织损伤。为阐明AM-AS@CDs的免疫调控作用，对外周血及酶解后的肾脏组织进行高通量流式细胞术检测。结果显示，给予AM-AS@CDs可显著降低外周血中性粒细胞（Ly6G⁺CD11b⁺）与总T淋巴细胞（CD3⁺）比例（图7a、b），且不会改变CD4⁺/CD8⁺T细胞比值。与之相符，肾脏组织内浸润的中性粒细胞（Ly6G⁺CD11b⁺）与巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺）数量也明显减少（图7c、d）。RT-qPCR结果证实，AM-AS@CDs可下调Ccl2、Ccl7、Ccl20、Cxcl1等关键趋化因子基因的转录水平（图7e-h）。Western Blot显示其显著降低NF-κB蛋白表达，并抑制TNFα和IL-1β等核心促炎细胞因子的转录。 综上，AM-AS@CDs可通过阻断趋化因子-受体信号轴，抑制免疫细胞外渗浸润，阻断后续炎症级联反应，进而减轻缺血再灌注介导的肾脏损伤。

图7 AM-AS@CDs减轻肾缺血再灌注损伤小鼠外周血与肾脏组织内的免疫细胞浸润

【AM-AS@CDs缓解缺血再灌注损伤引发的肾脏氧化应激】

为进一步阐明AM-AS@CDs在肾I/R损伤中的肾脏保护分子机制，于再灌注48小时后提取小鼠肾脏总RNA进行文库制备和高通量测序。差异表达分析鉴定出与假手术组相比，肾缺血再灌注组肾脏组织中1455个上调基因和1271个下调基因；AM-AS@CDs治疗组较单纯缺血再灌注组中387个基因上调、221个基因下调；差异表达基因热图可视化显示各组转录谱特征鲜明且组内重复性高（图8a-c）。基因集富集分析（GSEA）揭示I/R肾脏中氧化应激和ROS生成相关基因集显著富集（图8d、e）；Western Blot进一步证实I/R诱发Nrf2/HO-1通路的代偿性激活，而AM-AS@CDs治疗使该通路恢复至基线水平，表明AM-AS@CDs能够重建I/R损伤所破坏的氧化还原稳态（图8f、g）。RT-qPCR分析显示，AM-AS@CDs显著上调SOD1、SOD2、SOD3、GPX4及CAT的转录水平（图8h），提示其抗氧化机制在于抑制ROS累积的同时保护内源性抗氧化酶基因表达。

图8 AM-AS@CDs减轻缺血再灌注损伤小鼠肾脏氧化应激

【基于转录组解析AM-AS@CDs调控肾脏保护作用的分子调控网络】

为明确介导AM-AS@CDs发挥肾脏保护作用的核心调控网络，研究将假手术组 vs缺血再灌注组与缺血再灌注联合AM-AS@CDs组 vs 单纯缺血再灌注组筛选得到的差异表达基因进行交集分析，最终筛选出328个表达趋势一致的共有差异基因（图9a）。GO和KEGG富集分析显示这些基因主要参与细胞因子受体结合、白细胞迁移、IL-17及TNF信号通路（图9b、c）。热图及验证实验表明，AM-AS@CDs显著抑制趋化因子（Ccl2、Ccl7、Ccl20、Cxcl1）及S100蛋白表达，并下调转录因子Fosl1和c-Jun的表达及磷酸化水平（图9d-f）。作为AP-1复合物的核心组分，Fosl1/c-Jun通过激活趋化因子转录驱动免疫细胞招募；AM-AS@CDs通过抑制c-Jun/Fosl1/AP-1信号轴，有效阻断趋化因子介导的炎症级联反应，从而发挥肾脏保护作用。

图9 转录组测序解析肾缺血再灌注损伤及AM-AS@CDs干预的生物学机制

2. 全文总结：

综上，本研究提出一种将两种功效互补的中药材复配作为碳点前驱体的全新制备策略。所制备的AM-AS@CDs融合了天然中药的药理活性与纳米酶优异的抗氧化性能，其肾脏保护效果显著优于单味中药制备的碳点。本研究证实复方中药源碳点可稳定保留高效生物活性，并系统阐明了其治疗应用价值。该研究成果不仅为利用天然药用资源研发功能性纳米酶、治疗缺血再灌注相关疾病提供了全新研究思路，也搭建了良好的新型生物材料研发平台。

参考资料：

https://doi.org/10.1002/advs.75596

来源：EngineeringForLife

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