PBJ |南京林大尹增芳课题组与合作团队提出基于雄性育性分子靶向抑制的长芒苋防控新策略

1. ApmiR319可作为调控长芒苋雄性育性的有效分子靶标

研究团队克隆了参与花药发育的关键基因ApMIR319，利用拟南芥异源表达体系进行基因功能鉴定（图1a,b）。结果显示，ApMIR319过表达株系的雄蕊发育异常，具体表现为雄蕊缩短、花粉产量下降、花粉败育率升高（图1c–e,h,i）。此外，ApMIR319的组成型过表达还导致角果长度和种子数量显著减少（图1f,g,j,k）。综上所述，ApmiR319的上调表达能有效降低雄性育性，可作为调控长芒苋繁殖力的一个关键分子靶标。

2. LDH纳米材料的制备及表征分析

纳米载体的制备是实现外源核酸向植物体内高效递送的前提。研究团队通过水热共沉淀法合成了MgAl LDH纳米材料，并进行了表征分析。电镜观察显示，LDH纳米材料具有典型的六边形片层结构（图2a–c），平均粒径为93.45 nm（图2d）。X射线衍射（XRD）及傅里叶变换红外光谱（FTIR）的分析结果均证实该材料具有典型MgAl LDH纳米片的特征（图2e,f）。当LDH纳米颗粒分散于ddH2O中时，测得的zeta电位为+35.9 mV（图S1）。

3. LDH-ApmiR319 mimic纳米复合体的制备与稳定性分析

以所制备的LDH纳米材料为载体，在1：100的质量比下，实现了对ApmiR319 mimic的近乎完全负载（图3）。释放动力学分析表明，一旦形成复合体，ApmiR319 mimic能稳定地负载于LDH纳米片中，24 h内仅观察到微量释放；当时间延长至48–72 h，其释放量明显增加（图S2）。随后，研究人员在实验室条件下系统评估了LDH-ApmiR319 mimic纳米复合体的附着性和稳定性。将Cy3、ApmiR319 mimic-Cy3、Cy3@LDH及ApmiR319 mimic-Cy3@LDH分别喷洒于长芒苋叶片背面，24 h后进行冲洗，并利用激光共聚焦显微镜观察荧光变化情况。清洗前，经Cy3或ApmiR319 mimic-Cy3处理的叶片荧光信号较弱，清洗后信号几乎不可见（图4a,c）。相比之下，经Cy3@LDH和ApmiR319 mimic-Cy3@LDH处理的叶片，在清洗前后均保持了稳定的荧光信号强度（图4b,d）。为评估该复合物在不同pH条件下的稳定性，将其在pH2.0至12.0的水溶液中重悬5 min。结果表明，与酸性条件相比，LDH-ApmiR319 mimic复合体在中性及碱性环境中更为稳定（图4e,S3）。此外，通过RNase A处理试验评估了LDH纳米片保护双链RNA免受降解的能力。琼脂糖凝胶电泳结果显示，裸露的ApmiR319 mimic经RNase处理后完全降解，荧光信号消失，而负载于LDH的ApmiR319 mimic降解程度较低，在凝胶基质和上样孔中均观察到强烈的荧光信号（图4f）。上述研究结果显示，LDH-ApmiR319 mimic复合体不仅在中性至碱性条件下具有更稳定的负载性能，还能增强叶片附着力并有效抵抗核酸酶降解。

4. LDH-ApmiR319 mimic复合体的内化与转运

ApmiR319 mimic通过叶片表面进入植物细胞的内化与转运过程，是实现其生物学功能的关键。试验分别对长芒苋叶片背面基部区域喷洒了Cy3、ApmiR319 mimic–Cy3、Cy3@LDH及ApmiR319 mimic–Cy3@LDH（图5a）。结果显示，经Cy3或ApmiR319 mimic–Cy3处理的叶片均未观察到Cy3荧光信号（图5b）。与其形成鲜明对比的是，Cy3@LDH和ApmiR319 mimic–Cy3@LDH处理组的叶片中均观察到明显的绿色荧光信号，且与同一细胞层的叶绿素自发荧光信号发生共定位。此外，在Cy3@LDH与ApmiR319 mimic–Cy3@LDH处理组中，未经处理的叶脉区域也观察到了绿色荧光信号（图5b）。上述结果表明，ApmiR319 mimic能在LDH纳米片协助下内化进入叶肉细胞，并随后沿叶片维管系统进行系统性转运。

5. LDH-ApmiR319 mimic纳米复合体可抑制长芒苋雄性育性

为评估外源ApmiR319 mimic对长芒苋雄性育性的调控作用，于雄花序小花分化期分别喷施LDH和ApmiR319 mimic@LDH（喷施剂量均为125 µL/cm²）。喷施处理7 d后，在植株进入开花阶段时（图6a），采集样本进行RT-qPCR分析。结果表明，外源ApmiR319 mimic的施用显著上调了雄花中ApmiR319的表达水平，同时下调了其靶基因ApTCP4、ApTCP10与ApMYB33的表达（图6b）。经ApmiR319 mimic@LDH处理的雄花序，其上部与基部区域小花（尤其花药）的表观未表现出明显的改变（图S4），但是其花粉畸形率升高：花序上部区域达98.70%，基部区域为90.00%（图6c,d,f）。此外，ApmiR319 mimic@LDH处理显著降低了花粉的活力，花序上部区域花粉活力降至4.01%，基部区域降至37.01%（图6e,g）。上述研究结果证实，通过LDH纳米片递送ApmiR319 mimic，能够实现对长芒苋雄性育性的有效抑制。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70564

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